Kalıtsal Spastik Paraplejide İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronlarda Mitokondriyal Taşıma ve Morfolojinin Analizi
Summary
Bozulmuş mitokondriyal taşıma ve morfolojisi çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda rol oynamaktadır. Sunulan protokol, kalıtsal spastik paraplejide mitokondriyal taşıma ve morfolojiyi değerlendirmek için indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı ön beyin nöronlarını kullanır. Bu protokol, aksonların boyunca mitokondriyal ticaretinin karakterizasyonuna ve nörodejeneratif hastalıkların incelenmesini kolaylaştıracak morfolojilerinin analizine olanak sağlamaktadır.
Abstract
Nöronlar işlevlerini desteklemek için yüksek enerji için yoğun talepleri var. Aksonları boyunca bozulmuş mitokondriyal taşıma insan nöronlarında gözlenmiştir, hangi çeşitli hastalık durumlarında nörodejenerasyon katkıda bulunabilir. Canlı insan sinirlerinde mitokondriyal dinamikleri incelemek zor olsa da, bu tür paradigmalar nörodejenerasyonda mitokondrinin rolünü incelemek için kritik öneme sahiptir. Burada açıklanan insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSCs) elde edilen ön beyin nöron aksonları mitokondriyal taşıma ve mitokondriyal morfoloji analiz etmek için bir protokoldür. IPSCs iyi kurulmuş yöntemler kullanılarak telensefalik glutamaterjik nöronlar ayrılır. Nöronların Mitokondrisi MitoTracker CMXRos ile boyanmış, ve aksonlar içinde mitokondriyal hareket hücre kültürü için bir kuluçka ile donatılmış bir canlı hücre görüntüleme mikroskobu kullanılarak yakalanır. Hızlandırılmış görüntüler “MultiKymograph”, “Bioformat importer” ve “Macros” eklentileri içeren yazılımlar kullanılarak analiz edilir. Mitokondriyal taşımanın mitokondriyal taşımanın miyografları oluşturulur ve anterograd ve retrograd yönlerde ortalama mitokondriyal hız kymograflardan okunur. Mitokondriyal morfoloji analizi ile ilgili olarak, mitokondriyal uzunluk, alan ve en boy oranı ImageJ kullanılarak elde edilir. Özetle, bu protokol nörodejeneratif hastalıkların çalışmalarını kolaylaştırmak için akson boyunca mitokondriyal ticaretin karakterizasyonuve morfolojilerinin analizine olanak sağlamaktadır.
Introduction
Mitokondriyal hareketlilik ve dağılım polarize nöronlarda değişken ve özel enerjik taleplerin karşılanmasında hayati bir rol oynamaktadır. Nöronlar, Ca2+ tamponlama ve iyon akımları için yüksek düzeyde enerji gerektiren sinapsoluşumu yoluyla hedeflerle bağlantı kurmak için son derece uzun aksonları genişletebilirler. Mitokondrinin somadan aksona taşınması nöronların aksonal ve sinaptik fonksiyonunu desteklemek için çok önemlidir. Mekansal ve zamansal dinamik mitokondriyal hareket saniyede birkaç mikrometre hızlarda hızlı aksonal taşıma ile yapılır1.
Özellikle, motor veya adaptör proteinleri, kinesin ve dinin in gibi, mitokondri hareketini kontrol etmek için mikrotübüller boyunca hızlı organel taşıma katılmak2,3. Normal nöronal aktivite, nöronal somadan distal aksona (anterograd aksonal taşıma) ve mitokondrinin distal aksondan hücre gövdesine geri geri taşınmasına (retrograd taşıma) yeni monte edilmiş mitokondrinin uygun şekilde taşınmasını gerektirir. Son çalışmalar uygunsuz mitokondriyal ayırma kuvvetle nöronal defektler ve motor nöron dejeneratif hastalıklar ile ilişkili olduğunu göstermiştir4,5. Bu nedenle, nörodejenerasyon da mitokondri rolünü incelemek için, canlı kültürlerde akson boyunca mitokondriyal hareketi incelemek için yöntemler kurmak önemlidir.
Mitokondrinin izlenmesinin incelenmesi ve analiz edilmesinde iki temel zorluk vardır: (1) her çerçevede arka plandan mitokondrinin tanımlanması ve (2) her kare arasındaki bağlantıların analiz edilmesi ve üretilmesi. İlk zorluğun çözümünde, mitokondriyi arka plandan ayırt etmek için yaygın olarak bir floresan etiketleme yaklaşımı kullanılır, örneğin MitoTracker boya veya floresan erimiş mitokondriyal hedefleme proteininin transfeksiyonu (örn. mito-GFP)6,7,8. Çerçeveler arasındaki ilişkiyi analiz etmek için, çeşitli algoritmalar ve yazılım araçları önceki çalışmalarda tanımlanmıştır9. Yakın tarihli bir makalede, araştırmacılar mitokondriyal taşımayı ölçmek için dört farklı otomatik aracı (örneğin, Volocity, Imaris, wrMTrck ve Difference Tracker) karşılaştırdılar. Sonuçlar, pist uzunluğu, mitokondriyal deplasman, hareket süresi ve hız daki farklılıklara rağmen, bu otomatik araçların tedavi sonrası taşıma farkını değerlendirmek için uygun olduğunu gösterdi10. Bu araçlara ek olarak, ImageJ için entegre bir eklenti “Makrolar” (Rietdorf ve Seitz tarafından yazılmış) yaygın mitokondriyal taşıma analiz etmek için kullanılmıştır11. Bu yöntem, hem anterograd hem de retrograd yönlerde hız da dahil olmak üzere mitokondriyal hareketi analiz etmek için kullanılabilecek kymograflar oluşturur.
Mitokondri, hem fizyolojik hem de patolojik durumlara yanıt olarak sayı ve morfolojide sürekli olarak değişen son derece dinamik organellerdir. Mitokondriyal fizyon ve füzyon mitokondriyal morfolojive homeostazı sıkı bir şekilde düzenler. Mitokondriyal fizyon ve füzyon arasındaki dengesizlik son derece kısa veya uzun mitokondriyal ağları neden olabilir, hangi mitokondriyal fonksiyon bozabilir ve anormal nöronal aktiviteler ve nörodejenerasyon neden olabilir. Bozulmuş mitokondriyal ulaşım ve morfoloji alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, Huntington hastalığı ve kalıtsal spastik parapleji (HSP)12,13,14,15gibi çeşitli nörodejeneratif hastalıklar, yer almaktadır. HSP, kortikospinal sistemin dejenerasyonu ve alt ekstremite kaslarının kontrol altına alınmaması ile karakterize kalıtsal nörolojik hastalıkların heterojen bir grubudur16,17. Bu çalışmada HSP’de mitokondriyal taşıma ve morfolojiyi değerlendirmek için iPSC kaynaklı ön beyin nöronlar kullanılmaktadır. Bu yöntem canlı kültürlerde nöronal aksonların mitokondriyal dinamikleri incelemek için benzersiz bir paradigma sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, her ikisi de nörodejeneratif hastalıkaksonal dejenerasyon ve mitokondriyal morfoloji çalışma için benzersiz bir platform sağlamak kırmızı floresan boya ve ImageJ yazılımı kullanarak nöronal aksonlarda mitokondriyal taşıma ve morfoloji analiz etmek için bir yöntem açıklanır. Protokolde mitokondri boyama, canlı hücre görüntüleme ve görüntüleri analiz dahil olmak üzere çeşitli kritik adımlar vardır. Bu yöntemde mitokondriyi lekelemek için floresan boya kullanılmıştır. İn…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Spastik Parapleji Vakfı, Blazer Vakfı ve NIH (R21NS109837) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
Referências
- Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
- Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).
- Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
- Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
- Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).
- Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
- Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer’s disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
- Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
- Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O’Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
- Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin’s interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington’s disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
- Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
- Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321 (2013).
- Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
- Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
- Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
- Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
- Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
- Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. Química. 20 (47), 15360-15374 (2014).
- Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
- Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
- Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
- De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
- Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
- Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
- Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
- Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
- Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
- Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1 (2016).
- Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
- Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
- Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. Characterization of mitochondrial transport in neurons. Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).
