Анализ митохондриального транспорта и морфологии в антропогенных плюрипотентных стволовых клеток, полученных нейронов в наследственной спастической параплегии
Summary
Нарушение митохондриального транспорта и морфологии участвуют в различных нейродегенеративных заболеваний. Представленный протокол использует индуцированные плюрипотентные стволовые клетки полученных нейронов мозга для оценки митохондриального транспорта и морфологии в наследственной спастической параплегии. Этот протокол позволяет охарактеризовать митохондрийный оборот по аксонам и анализ их морфологии, что облегчит изучение нейродегенеративных заболеваний.
Abstract
Нейроны имеют интенсивные потребности в высокой энергии для того, чтобы поддерживать свои функции. Нарушение митохондриального переноса вдоль аксонов наблюдается в человеческих нейронов, которые могут способствовать нейродегенерации в различных состояниях болезни. Хотя это сложно изучить митохондриальной динамики в живых человеческих нервов, такие парадигмы имеют решающее значение для изучения роли митохондрий в нейродегенерации. Описано здесь протокол для анализа митохондриального транспорта и митохондриальной морфологии в аксонах нейронов предмозга, полученных из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs). IPSCs дифференцированы в теленецефалические глутаметергические нейроны с использованием устоявшихся методов. Митохондрии нейронов окрашены MitoTracker CMXRos, а митохондриальные движения в аксонах фиксируются с помощью живого изображения микроскопа, оснащенного инкубатором для клеточной культуры. Изображения замедленного анализа анализируются с помощью программного обеспечения с помощью плагинов “MultiKymograph”, “Bioformat importer” и “Macros”. Сгенерированы гирографы митохондриального транспорта, а средняя митохондриальная скорость в антероградских и ретроградных направлениях считывается с кимографа. Что касается анализа митохондриальной морфологии, митохондриальной длины, области и соотношения сторон получаются с помощью ImageJ. Таким образом, этот протокол позволяет охарактеризовать митохондриальный оборот вдоль аксонов и анализ их морфологии для облегчения исследований нейродегенеративных заболеваний.
Introduction
Митохондриальная подвижность и распределение играют жизненно важную роль в выполнении переменных и специализированных энергетических требований в поляризованных нейронах. Нейроны могут расширять очень длинные аксоны, чтобы соединиться с целями через образование синапсов, которые требуют высоких уровней энергии для буферизации Ca2 и ионных токов. Перенос митохондрий от сомы к аксону имеет решающее значение для поддержки аксональной и синаптической функции нейронов. Пространственно и временно динамическое митохондриальное движение осуществляется быстрым аксональным транспортом со скоростью несколько микрометров всекунду 1.
В частности, моторные или адаптерные белки, такие как кинезин и динейн, участвуют в быстром переносе органелл ы вдоль микротрубок, чтобы контролировать движение митохондрий2,3. Нормальная нейрональная активность требует надлежащей транспортировки вновь собранных митохондрий от нейрональной сомы к дистальной аксон (антероградный аксональный транспорт) и обратной транспортировки митохондрий из дистального аксона обратно в клеточное тело (ретроградный транспорт). Недавние исследования показали, что неправильное распределение митохондрий тесно связано с дефектами нейронов и двигательных нейронных дегенеративных заболеваний4,5. Поэтому, чтобы вскрыть роль митохондрий в нейродегенерации, важно установить методы изучения митохондриального движения вдоль аксонов в живых культурах.
Существует две основные проблемы в изучении и анализе отслеживания митохондрий: (1) выявление митохондрий от фона в каждом кадре, и (2) анализ и генерация связей между каждым кадром. При решении первой задачи широко используется подход к маркировке флуоресценции для разграничения митохондрий от фона, таких как краситель MitoTracker или трансфекция флуоресценции, слитого митохондриального прицеливания белка (например, мито-ГФП)6,7,8. Для анализа связи между кадрами, несколько алгоритмов и программных средств были описаны в предыдущих исследованиях9. В недавней работе исследователи сравнили четыре различных автоматизированных инструмента (например, Volocity, Imaris, wrMTrck и Difference Tracker) для количественной оценки митохондриального транспорта. Результаты показали, что, несмотря на расхождения в длине трека, митохондриальной смещения, продолжительности движения и скорости, эти автоматизированные инструменты подходят для оценки разницы в транспортировке после обработки10. В дополнение к этим инструментам, интегрированный плагин “Macros” для ImageJ (написано Rietdorf и Seitz) широко используется для анализа митохондриального транспорта11. Этот метод генерирует kymographs, которые могут быть использованы для анализа митохондриальных движений, в том числе скорости как в антероградных и ретроградных направлениях.
Митохондрии являются высокодинамическими органеллами, которые постоянно меняются в численности и морфологии в ответ как на физиологические, так и на патологические состояния. Митохондриальная расщепление и слияние жестко регулируют митохондриальную морфологию и гомеостаз. Дисбаланс между митохондриальным делением и слиянием может вызвать чрезвычайно короткие или длинные митохондриальные сети, которые могут ухудшить митохондриальную функцию и привести к аномальной нейронной деятельности и нейродегенерации. Нарушение митохондриального транспорта и морфологии участвуют в различных нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, и наследственной спастической параплегии (HSP)12,13,14,15. HSP является неоднородной группой наследственных неврологических расстройств, характеризующихся дегенерацией кортикоспинального тракта и последующей неспособностью контролировать мышцы нижних конечностей16,17. В этом исследовании, iPSC полученных предмозг нейронов используются для оценки митохондриального транспорта и морфологии в HSP. Этот метод обеспечивает уникальную парадигму для изучения митохондриальной динамики нейрональных аксонов в живых культурах.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье описывается метод анализа митохондриального транспорта и морфологии в нейрональных аксонах с использованием красного флуоресцентного красителя и программного обеспечения ImageJ, оба из которых обеспечивают уникальную платформу для изучения аксональной дегенерации и мит…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Фондом Спастик Параплегия, Фондом Блейзера и NIH (R21NS109837).
Materials
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
Referências
- Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
- Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).
- Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
- Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
- Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).
- Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
- Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer’s disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
- Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
- Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O’Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
- Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin’s interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington’s disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
- Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
- Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321 (2013).
- Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
- Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
- Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
- Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
- Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
- Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. Química. 20 (47), 15360-15374 (2014).
- Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
- Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
- Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
- De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
- Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
- Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
- Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
- Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
- Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
- Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1 (2016).
- Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
- Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
- Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. Characterization of mitochondrial transport in neurons. Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).
