Analyse du transport mitochondrial et de la morphologie dans les neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans la paraplégie spastique héréditaire
Summary
Le transport mitochondrial altéré et la morphologie sont impliqués dans diverses maladies neurodegenerative. Le protocole présenté utilise des neurones de cerveaux avant dérivés de cellules souches pluripotentes induits pour évaluer le transport mitochondrial et la morphologie dans la paraplégie spastique héréditaire. Ce protocole permet la caractérisation du trafic mitochondrial le long des axones et l’analyse de leur morphologie, ce qui facilitera l’étude des maladies neurodégénératives.
Abstract
Les neurones ont des exigences intenses pour la haute énergie afin de soutenir leurs fonctions. Le transport mitochondrial altéré le long des axones a été observé dans les neurones humains, qui peuvent contribuer à la neurodégénérescence dans divers états de la maladie. Bien qu’il soit difficile d’examiner la dynamique mitochondriale dans les nerfs humains vivants, de tels paradigmes sont essentiels pour étudier le rôle des mitochondries dans la neurodégénérescence. Décrit ici est un protocole pour analyser le transport mitochondrial et la morphologie mitochondriale dans les axones de neurone de forebrain dérivés des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSCs). Les iPSC sont différenciés en neurones glutamatergiques telencéphaliques utilisant des méthodes bien établies. Les mitochondries des neurones sont tachées avec MitoTracker CMXRos, et le mouvement mitochondrial dans les axones sont capturés à l’aide d’un microscope d’imagerie à cellules vivantes équipé d’un incubateur pour la culture cellulaire. Les images en accéléré sont analysées à l’aide d’un logiciel avec des plugins “MultiKymograph”, “Bioformat importateur” et “Macros”. Des kymographes du transport mitochondrial sont produits, et la vitesse mitochondriale moyenne dans les directions antérogrades et rétrogrades est lue du kymographe. En ce qui concerne l’analyse de la morphologie mitochondriale, la longueur mitochondriale, la zone et le rapport d’aspect sont obtenus à l’aide de l’ImageJ. En résumé, ce protocole permet la caractérisation du trafic mitochondrial le long des axones et l’analyse de leur morphologie pour faciliter les études des maladies neurodégénératives.
Introduction
La motilité et la distribution mitochondriales jouent un rôle vital dans l’accomplissement des exigences énergétiques variables et spécialisées dans les neurones polarisés. Les neurones peuvent étendre les axones extrêmement longs pour se connecter avec les cibles grâce à la formation de synapses, qui exigent des niveaux élevés d’énergie pour la mise en mémoire tampon Ca2 et les courants ioniques. Le transport des mitochondries de soma à l’axone est essentiel pour soutenir la fonction axonale et synaptique des neurones. Le mouvement mitochondrial dynamique spatialement et temporellement est effectué par le transport axonal rapide à des taux de plusieurs micromètres par seconde1.
Plus précisément, les protéines motrices ou adaptatrices, telles que la kinésie et la dyneine, participent au transport rapide d’organelle le long des microtubules pour contrôler le mouvement des mitochondries2,3. L’activité neuronale normale exige le transport approprié des mitochondries nouvellement assemblées du soma neuronal à l’axone distal (transport axonal antérograde) et au transport inverse des mitochondries de l’axone distal de nouveau au corps cellulaire (transport rétrograde). Des études récentes ont indiqué que l’allocation mitochondriale incorrecte est fortement associée aux défauts neuronaux et aux maladies dégénératives de neurone moteur4,5. Par conséquent, pour disséquer le rôle des mitochondries dans la neurodégénérescence, il est important d’établir des méthodes pour examiner le mouvement mitochondrial le long des axones dans les cultures vivantes.
Il y a deux principaux défis dans l’examen et l’analyse du suivi des mitochondries : (1) identifier les mitochondries à partir de l’arrière-plan dans chaque image, et (2) analyser et générer les connexions entre chaque image. Pour résoudre le premier défi, une approche d’étiquetage de la fluorescence est largement utilisée pour distinguer les mitochondries de l’arrière-plan, comme le colorant MitoTracker ou la transfection de la protéine de ciblage mitochondrial fusionnée à la fluorescence (p. ex. mito-GFP)6,7,8. Pour analyser l’association entre les cadres, plusieurs algorithmes et outils logiciels ont été décrits dans des études antérieures9. Dans un article récent, les chercheurs ont comparé quatre outils automatisés différents (p. ex. Volocity, Imaris, wrMTrck et Difference Tracker) pour quantifier le transport mitochondrial. Les résultats ont montré que, malgré les écarts dans la longueur de la voie, le déplacement mitochondrial, la durée du mouvement et la vitesse, ces outils automatisés sont adaptés pour évaluer la différence de transport après le traitement10. En plus de ces outils, un plugin intégré “Macros” pour ImageJ (écrit par Rietdorf et Seitz) a été largement utilisé pour analyser le transport mitochondrial11. Cette méthode génère des kymographes qui peuvent être utilisés pour analyser le mouvement mitochondrial, y compris la vitesse dans les deux directions antérogrades et rétrogrades.
Les mitochondries sont des organites très dynamiques qui changent constamment de nombre et de morphologie en réponse à des conditions physiologiques et pathologiques. La fission mitochondriale et la fusion régulent étroitement la morphologie mitochondriale et l’homéostasie. Le déséquilibre entre la fission mitochondriale et la fusion peut induire des réseaux mitochondriaux extrêmement courts ou longs, ce qui peut altérer la fonction mitochondriale et entraîner des activités neuronales anormales et la neurodégénérescence. Le transport mitochondrial et la morphologie altérés sont impliqués dans diverses maladies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington, et la paraplégie spastique héréditaire (HSP)12,13,14,15. HSP est un groupe hétérogène de troubles neurologiques héréditaires caractérisés par la dégénérescence de la région corticospinal et l’échec ultérieur de contrôler les muscles des membres inférieurs16,17. Dans cette étude, les neurones de cerveau xavant iPSC-dérivés sont employés pour évaluer le transport mitochondrique et la morphologie dans HSP. Cette méthode fournit un paradigme unique pour examiner la dynamique mitochondriale des axones neuronaux dans les cultures vivantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article décrit une méthode pour analyser le transport mitochondrial et la morphologie dans les axones neuronaux utilisant le colorant fluorescent rouge et le logiciel d’ImageJ, qui fournissent tous deux une plate-forme unique pour étudier la dégénérescence axonale et la morphologie mitochondriale dans la maladie neurodegenerative. Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole, y compris la coloration des mitochondries, l’imagerie cellulaire vivante, et l’analyse des images. Dans cette méthode, un …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation Spastic Paraplegia, la Fondation Blazer et les NIH (R21NS109837).
Materials
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
Referências
- Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
- Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).
- Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
- Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
- Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).
- Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
- Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer’s disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
- Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
- Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O’Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
- Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin’s interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington’s disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
- Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
- Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321 (2013).
- Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
- Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
- Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
- Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
- Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
- Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. Química. 20 (47), 15360-15374 (2014).
- Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
- Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
- Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
- De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
- Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
- Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
- Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
- Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
- Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
- Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1 (2016).
- Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
- Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
- Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. Characterization of mitochondrial transport in neurons. Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).
