全斑马鱼胚胎的延长时移共聚焦显微镜的分层安装方法

斑马鱼长期以来一直是发育生物学的模型生物，显微镜是可视化胚胎发育的主要方法。使用斑马鱼胚胎进行发育研究的优点包括体积小、光学清晰度高、发育迅速和成年鱼的繁殖性高。转基因斑马鱼线在某些组织或细胞中表达荧光，使得组织发育能够以大型脊椎动物所无法得到的方式直接可视化。结合延时显微镜，可以很容易地研究组织发育的细节和动态。

成像斑马鱼发育的一个困难是胚胎长得很大;胚胎在生命前3天内伸展其长度4次^。此外，早期胚胎的身体是软的，如果生长受到限制，很容易被扭曲。然而，要进行共聚焦显微镜，胚胎必须固定。为了保持胚胎在固定位置进行共聚焦延时成像，它们定期进行麻醉，并安装在0.3-1%的低熔胶胶胶中。这样做的好处是允许在一定时期内在成像过程中进行一些生长，同时限制胚胎的运动。胚胎的某些部分可以有效地成像像这样。然而，当使用这种方法对整个胚胎进行长时间的成像时，由于生长受限，生长受限，观察到扭曲。因此，需要其他安装方法。考夫曼及其同事通过将斑马鱼胚胎安装在含有低浓度的琼脂糖或甲基纤维素²的氟化乙烯丙烯（FEP）管中，描述了一种用于光片显微镜的替代安装斑马鱼胚胎，如选择性平面照明显微镜（SPIM）。该技术可以随着时间的推移对胚胎的产生产生产生极好的可视化效果。Schmidi等人描述了在FEB管中为光片显微镜³在Agarose中安装多达6个胚胎，在一次成像中提供了多个胚胎的可视化效果。模具已经被用来创造胚胎阵列，以有效地安装更多的胚胎^4。Masselkink等人已经构建了3D打印塑料模具，可用于制造硅铸件，斑马鱼胚胎可以放置在不同阶段，使安装在一个恒定的位置成像，包括共聚焦成像^5。3D打印也被用来制造模具，以96井格式⁶一致定位斑马鱼胚胎。有些模具是针对特定阶段定制的，可能不允许长时间无限制的生长，而其他模具则更灵活。最近，Weijts等人发表了一种四井盘的设计和制造，用于斑马鱼胚胎的活成像^7。在这个菜中，麻醉鱼胚胎的尾巴和躯干被手动放置在一个清晰的硅胶屋顶下，紧贴在盖玻璃的上方，形成一个口袋。然后，通过添加0.4%的甘蔗，将胚胎固定在这个位置。这种安装允许对胚胎的约 2 mm 长的后部（树干和尾部）进行成像，并且由于每个井可以安装多达 12 个胚胎，该方法允许对多个样本进行成像。同样，希辛格和史蒂文顿最近提出了一种方法，其中鱼的头部安装在甘蔗，而尾巴可以自由生长，这种方法也有效地促进成像的树干和尾部区域的胚胎^8。

本文介绍了斑马鱼胚胎的分层安装方法，该方法限制胚胎的运动，同时允许不受限制的生长。这种安装方法的优点是，它是一种低成本、快速、简便的方法，可使用任何倒置显微镜安装不同阶段的胚胎进行成像。在胚胎发育过程中，安装允许对全身（头部、躯干和尾部）进行长期成像。为了展示这种方法的可用性，整个胚胎血管，神经元和肌肉发育在转基因鱼的图像。每期两个胚胎，在3D的两个波长被图像的延时显微镜连续55小时，以呈现电影的组织发展。