Слойный монтаж Метод для расширенного времени Lapse Конфокальная микроскопия целых эмбрионов зебрафиш
Summary
В этой статье описывается метод установки хрупких эмбрионов зебры для длительного замедленного конфокальной микроскопии. Этот недорогой метод легко выполнять с помощью обычной стеклянной нижней микроскопии блюда для визуализации на любой перевернутый микроскоп. Монтаж выполняется слоями агарозы в разных концентрациях.
Abstract
Динамика развития может сопровождаться конфокальной замедленной микроскопией живых трансгенных эмбрионов зебры, выражающих флуоресценцию в конкретных тканях или клетках. Трудность с визуализацией всего эмбриона заключается в том, что эмбрионы зебры существенно растут в длину. При установке, как это регулярно делается в 0,3-1% низкорасплавленного агарозы, агароз налагает ограничение роста, что приводит к искажениям в мягком организме эмбриона. Тем не менее, для выполнения конфокальной замедленной микроскопии, эмбрион должен быть обездвижен. В этой статье описывается слоистый метод монтажа эмбрионов зебры, которые ограничивают подвижность эмбрионов, позволяя неограниченный рост. Монтаж выполняется слоями агарозы в разных концентрациях. Чтобы продемонстрировать удобство использования этого метода, весь эмбрион сосудистой, нейрональной и мышечной развития был изображен в трансгенных рыб в течение 55 часов подряд. Этот метод монтажа может быть использован для легкой, недорогой визуализации целых эмбрионов зебры с помощью перевернутых микроскопов без требований плесени или специального оборудования.
Introduction
Зебрафиш уже давно является образцовым организмом для биологии развития, а микроскопия является основным методом визуализации эмбрионального развития. Преимущества использования эмбрионов зебры для исследований в области развития включают небольшой размер, оптическую ясность, быстрое развитие и высокую плодовитость взрослых рыб. Поколение трансгенных линий зебры, выражающих флуоресценцию в определенных тканях или клетках, позволило напрямую визуализировать развитие тканей способами, которые невозможны с более крупными позвоночными животными. В сочетании с замедленной микроскопией можно легко изучить детали и динамику развития тканей.
Трудность с развитием изображения зебры заключается в том, что эмбрионы существенно растут в длину; эмбрион продлевает свою длину четыре раза в течение первых 3 дней жизни1. Кроме того, тело раннего эмбриона мягкое, и легко становится искаженным, если рост ограничен. Тем не менее, для выполнения конфокальной микроскопии, эмбрион должен быть обездвижен. Чтобы сохранить эмбрионы в фиксированном положении для конфокальной визуализации покадровой, они регулярно обезопасиваются и устанавливаются в 0,3-1% низкорасплавленной агарозы. Это имеет то преимущество, что позволяет для некоторого роста во время визуализации в течение определенного периода времени, ограничивая движения эмбриона. Части эмбриона можно эффективно отобразить вот так. Однако при использовании этого метода для визуализации всего эмбриона в течение длительных периодов времени наблюдаются искажения из-за ограниченного роста, вызванного агарозой. Таким образом, требуются другие методы монтажа. Кауфманн и его коллеги описали альтернативное монтаж эмбрионов зебры для микроскопии светового листа, таких как селективная микроскопия освещения самолета (SPIM), путем установки эмбрионов в флюиринированный этилен пропилен (FEP) трубки, содержащие низкие концентрации агарозы или метилцеллюлозы2. Этот метод производит превосходную визуализацию эмбриогенеза с течением времени. Шмид и др. описывают монтаж до шести эмбрионов в агарозе в трубках FEB для светолистой микроскопии3, обеспечивающей визуализацию нескольких эмбрионов за один сеанс визуализации. Формы были использованы для создания эмбрионов массивов для эффективного монтажа большего числа эмбрионов4. Masselkink и др. построили 3D печатных пластиковых форм, которые могут быть использованы для кремния слепки, что эмбрионы зебры на разных стадиях могут быть помещены в, что позволяет монтаж в постоянном положении для визуализации, в том числе confocal изображений5. 3D печать также была использована для изготовления форм для последовательного позиционирования эмбрионов зебры в 96-хорошем формате6. Некоторые формы настроены для определенных этапов и не может позволить неограниченный рост в течение длительных периодов времени, в то время как другие формы являются более гибкими. Недавно, Weijts et al. опубликовалдизайн дизайн и изготовление блюда из четырех колодцев для живой визуализации эмбрионов зебры7. В этом блюде хвост и ствол обезеченных эмбрионов рыб помещаются вручную под прозрачую силиконовую крышу, прикрепленную чуть выше крышки стекла, чтобы сформировать карман. Эмбрион затем фиксируется в этом положении путем добавления 0,4% агарозы. Это крепление позволяет для изображения около 2 мм длинной задней части (ствол и хвост) эмбриона, и, как до 12 эмбрионов могут быть установлены на скважину, метод позволяет для изображения нескольких образцов. Аналогичным образом, Хирсингер и Стивентон недавно представили метод, где голова рыбы установлена в агарозе, в то время как хвост может свободно расти, и этот метод также эффективно облегчает визуализацию ствола и хвоста области эмбриона8.
В этой статье описывается слоистый метод монтажа эмбрионов зебры, которые ограничивают движения эмбрионов, обеспечивая при этом неограниченный рост. Преимущества этого монтажного метода в том, что это недорогой, быстрый и простой метод установки эмбрионов различных стадий для визуализации с помощью любого перевернутого микроскопа. Монтаж позволяет проводить долгосрочную визуализацию всего тела (головы, туловища и хвоста) во время развития эмбриона. Чтобы продемонстрировать удобство использования этого метода, весь эмбрион сосудистой, нейрональной и мышечной развития был изображен в трансгенных рыб. Два эмбриона за сеанс, на двух длинах волн в 3D были изображены замедленной микроскопией в течение 55 часов подряд, чтобы сделать фильмы развития тканей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь описан монтажный метод для длительного замедленного конфокальной микроскопии целых эмбрионов зебры. Наиболее важным шагом для монтажного метода является определение оптимальной концентрации агарозы, которая позволит неограниченному росту эмбрионов зебры, и в то же время держ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Альберта Пана и Арндта Сиакмана за дары трансгенной рыбы. Мы благодарим Коити Каваками в Национальном институте генетики, Национальный проект биоресурсов от Министерства образования, культуры, спорта, науки и техники Японии за подарок трансгенных зебры HGn39b. Мы также благодарим Фатиму Мерчант и Кэтлин Гаевски за помощь в конфокальной микроскопии и Трейси Териао за фотографии.
Эта работа была поддержана грантами Национального института экологических наук здоровья Национальных институтов здравоохранения (грант номер P30ES023512 и номер контракта HHSN273201501500010C). SU была поддержана стипендией от программы биологии рака Кека вычислительной (Консорциум побережья Мексиканского залива CPRIT грант RP140113) и Хью Роя и Фонда Лили. J-A G была поддержана Фондом Роберта А. Уэлча (E-0004).
Materials
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| Micro cover glass 22×22 mm | VWR | 48366 067 | |
| Leica DMi8 fluorescence microscope | Leica | NA | |
| LAS X software | Leica | NA | Microscope software |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Nikon A1S confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | NA | |
| Nikon NIS AR Version 4.40 | Nikon Instruments Inc. | NA | Microscope software |
Referências
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nature Communications. 4, 2207 (2013).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
- Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing. BMC Biotechnology. 14, 36 (2014).
- Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish. Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).
- Hirsinger, E., Steventon, B. A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development. Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiment. (69), e4196 (2012).
- McCollum, C. W., et al. Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish. Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).
- Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
- Nagayoshi, S., et al. Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like. Development. 135 (1), 159-169 (2008).
- Huang, W. C., et al. Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish. Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).
- Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), 0134005 (2015).
