पूरे ज़ेब्राफिश भ्रूण की विस्तारित समय-चूक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए एक स्तरित बढ़ते विधि
Summary
यह लेख विस्तारित समय-चूक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए नाजुक ज़ेब्राफिश भ्रूण को माउंट करने की विधि का वर्णन करता है। यह कम लागत वाली विधि किसी भी उल्टे माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग के लिए नियमित ग्लास-बॉटम माइक्रोस्कोपी व्यंजनों का उपयोग करना आसान है। बढ़ते विभिन्न सांद्रता पर अगारोज की परतों में किया जाता है।
Abstract
विकास की गतिशीलता के बाद विशिष्ट ऊतकों या कोशिकाओं में फ्लोरेसेंस व्यक्त करने वाले लाइव ट्रांसजेनिक जेब्राफिश भ्रूण की कॉन्फोकल टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी के बाद किया जा सकता है। इमेजिंग पूरे भ्रूण विकास के साथ एक कठिनाई यह है कि जेब्राफिश भ्रूण लंबाई में काफी बढ़ते हैं। जब नियमित रूप से 0.3-1% कम पिघल अगारोज में किया जाता है, तो अगारोज विकास प्रतिबंध लगाता है, जिससे नरम भ्रूण शरीर में विकृतियां होती हैं। फिर भी, कॉन्फोकल टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी करने के लिए, भ्रूण को स्थिर किया जाना चाहिए। यह लेख जेब्राफिश भ्रूण के लिए एक स्तरित बढ़ते विधि का वर्णन करता है जो अप्रतिबंधित विकास के लिए अनुमति देते समय भ्रूण की गतिशीलता को प्रतिबंधित करता है। बढ़ते विभिन्न सांद्रता पर अगारोज की परतों में किया जाता है। इस विधि की प्रयोज्यता को प्रदर्शित करने के लिए, पूरे भ्रूण संवहनी, न्यूरोनल और मांसपेशियों के विकास को लगातार 55 घंटों तक ट्रांसजेनिक मछली में चित्रित किया गया था। इस बढ़ते विधि मोल्डों या विशेष उपकरणों की आवश्यकताओं के बिना उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग कर पूरे जेब्राफिश भ्रूण की आसान, कम लागत वाली इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
जेब्राफिश लंबे समय से विकासात्मक जीव विज्ञान के लिए एक आदर्श जीव रहा है, और माइक्रोस्कोपी भ्रूणीय विकास की कल्पना करने के लिए प्रमुख तरीका है। विकासात्मक अध्ययनों के लिए ज़ेब्राफिश भ्रूण का उपयोग करने के फायदे छोटे आकार, ऑप्टिकल स्पष्टता, तेजी से विकास, और वयस्क मछली की उच्च fecundity शामिल हैं । कुछ ऊतकों या कोशिकाओं में फ्लोरेसेंस व्यक्त करने वाली ट्रांसजेनिक जेब्राफिश लाइनों की पीढ़ी ने बड़े कशेरुकी जानवरों के साथ संभव नहीं तरीकों से ऊतक विकास के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति दी है। समय चूक माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में, विवरण और ऊतक विकास की गतिशीलता आसानी से अध्ययन किया जा सकता है।
इमेजिंग जेब्राफिश विकास के साथ एक कठिनाई यह है कि भ्रूण लंबाई में काफी बढ़ते हैं; भ्रूण जीवन के पहले 3 दिनों के भीतर चार बार अपनी लंबाई फैली हुईहै 1. इसके अलावा, प्रारंभिक भ्रूण का शरीर नरम होता है, और यदि विकास प्रतिबंधित हो जाता है तो आसानी से विकृत हो जाता है। फिर भी, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी करने के लिए, भ्रूण को स्थिर किया जाना चाहिए। भ्रूण को कॉन्फोकल टाइम-लैप्स इमेजिंग के लिए एक निश्चित स्थिति में रखने के लिए, वे नियमित रूप से एनेस्थेटाइज्ड होते हैं और 0.3-1% कम पिघलने वाले अगारोज में घुड़सवार होते हैं। यह समय की एक निश्चित अवधि के लिए इमेजिंग के दौरान कुछ विकास के लिए अनुमति देने का लाभ है, जबकि भ्रूण के आंदोलनों को प्रतिबंधित । भ्रूण के कुछ हिस्सों को कुशलतापूर्वक इस तरह से चित्रित किया जा सकता है। हालांकि, विस्तारित समय अवधि के लिए पूरे भ्रूण की इमेजिंग के लिए इस विधि का उपयोग करते समय, अगारोज के कारण प्रतिबंधित विकास के कारण विकृतियों को देखा जाता है। इस प्रकार, अन्य बढ़ते तरीकों की आवश्यकता होती है। काउफमैन और सहयोगियों ने प्रकाश पत्र माइक्रोस्कोपी के लिए जेब्राफिश भ्रूण के बढ़ते एक विकल्प का वर्णन किया है, जैसे चयनात्मक विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी (एसपीआईएम), फ्लोरिनेट एथिलीन प्रोपलीन (एफईपी) ट्यूबों में भ्रूण को बढ़ते हुए अगारोज या मिथाइलसेल्यूलोज2की कम सांद्रता वाले । यह तकनीक समय के साथ भ्रूण उत्पत्ति का एक शानदार दृश्य पैदा करती है। श्मिड एट अल. प्रकाश पत्र माइक्रोस्कोपी3 के लिए फ़रवरी ट्यूबों में agarose में छह भ्रूण के बढ़ते का वर्णन एक इमेजिंग सत्र में कई भ्रूण के दृश्य प्रदान करते हैं । मोल्डों का उपयोग भ्रूण की बड़ी संख्या के कुशल बढ़ते के लिए भ्रूण सरणी बनाने के लिए किया गया है। मैस्एल्कंक एट अल ने 3 डी मुद्रित प्लास्टिक मोल्डों का निर्माण किया है जिनका उपयोग सिलिकॉन कास्ट बनाने के लिए किया जा सकता है कि विभिन्न चरणों में जेब्राफिश भ्रूण को रखा जा सकता है, जिससे इमेजिंग के लिए निरंतर स्थिति में बढ़ते हुए, जिसमें कॉन्फोकल इमेजिंग5शामिल हैं। 96-वेल प्रारूप6में जेब्राफिश भ्रूण की लगातार स्थिति के लिए मोल्ड बनाने के लिए 3डी प्रिंटिंग का भी उपयोग किया गया है। कुछ मोल्डों को कुछ चरणों के लिए अनुकूलित किया जाता है और लंबे समय तक अप्रतिबंधित विकास की अनुमति नहीं दे सकते हैं, जबकि अन्य मोल्ड अधिक लचीले होते हैं। हाल ही में, Weijts एट अल जेब्राफिश भ्रूण7के लाइव इमेजिंग के लिए एक चार अच्छी तरह से पकवान के डिजाइन और निर्माण प्रकाशित किया । इस डिश में, एनेस्थेटाइज्ड मछली भ्रूण की पूंछ और ट्रंक को जेब बनाने के लिए एक कवर ग्लास के ठीक ऊपर संलग्न एक स्पष्ट सिलिकॉन छत के नीचे मैन्युअल रूप से रखा जाता है। इसके बाद भ्रूण को 04% अगारोज के अलावा इस स्थिति में तय किया जाता है। यह बढ़ते भ्रूण के बारे में 2 मिमी लंबे पीछे भाग (ट्रंक और पूंछ) की इमेजिंग के लिए अनुमति देता है, और के रूप में 12 भ्रूण के लिए अच्छी तरह से प्रति घुड़सवार किया जा सकता है, विधि कई नमूनों की इमेजिंग के लिए अनुमति देता है । इसी तरह, हिरसिंगर और स्टीवर्टन ने हाल ही में एक विधि प्रस्तुत की जहां मछली के सिर को अगारोज में रखा जाता है, जबकि पूंछ स्वतंत्र रूप से बढ़ सकती है, और यह विधि भ्रूण8के ट्रंक और पूंछ क्षेत्र की इमेजिंग को भी कुशलतापूर्वक सुविधा प्रदान करती है।
यह लेख जेब्राफिश भ्रूण के लिए एक स्तरित बढ़ते विधि का वर्णन करता है जो अप्रतिबंधित विकास की अनुमति देते हुए भ्रूण के आंदोलनों को प्रतिबंधित करता है। इस बढ़ते विधि के फायदे यह हैं कि किसी भी उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इमेजिंग के लिए विभिन्न चरणों के भ्रूण को माउंट करने के लिए यह एक कम लागत, तेज और आसान तरीका है। बढ़ते भ्रूण विकास के दौरान पूरे शरीर (सिर, ट्रंक और पूंछ) की दीर्घकालिक इमेजिंग की अनुमति देता है । इस विधि की प्रयोज्यता को प्रदर्शित करने के लिए, ट्रांसजेनिक मछली में पूरे भ्रूण संवहनी, न्यूरोनल और मांसपेशियों के विकास को चित्रित किया गया था। सत्र प्रति दो भ्रूण, 3 डी में दो तरंगदैर्ध्य पर लगातार ५५ घंटे के लिए समय चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित करने के लिए ऊतक विकास की फिल्में प्रदान की गई ।
Protocol
Representative Results
Discussion
पूरे जेब्राफिश भ्रूण की विस्तारित समय-चूक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए एक बढ़ते विधि का वर्णन यहां किया गया है। बढ़ते विधि के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम अगारोज की इष्टतम एकाग्रता की पहचान करना है जो अप?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम ट्रांसजेनिक मछली के उपहार के लिए अल्बर्ट पैन और Arndt Sieakmann शुक्रिया अदा करते हैं । हम ट्रांसजेनिक जेब्राफिश एचजीएन39बीके उपहार के लिए जापान के शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय से राष्ट्रीय जैव संसाधन परियोजना, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जेनेटिक्स में कोइची कावाकामी को धन्यवाद देते हैं । हम फातिमा मर्चेंट और कैथलीन गैजेस्की को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी पर सहायता के लिए और तस्वीरों के लिए ट्रेसी थेरियाल्ट का भी शुक्रिया अदा करते हैं ।
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (अनुदान संख्या P30ES023512 और अनुबंध संख्या HHSN273201500010C) के पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । एसयू को केक कम्प्यूटेशनल कैंसर बायोलॉजी प्रोग्राम (गल्फ कोस्ट कंसोर्टिया सीपीआरआईटी ग्रांट RP140113) और ह्यूग रॉय और लिली एंडोमेंट फंड द्वारा एक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था। जे-Å जी रॉबर्ट ए वेल्च फाउंडेशन (ई-0004) द्वारा समर्थित था।
Materials
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| Micro cover glass 22×22 mm | VWR | 48366 067 | |
| Leica DMi8 fluorescence microscope | Leica | NA | |
| LAS X software | Leica | NA | Microscope software |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Nikon A1S confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | NA | |
| Nikon NIS AR Version 4.40 | Nikon Instruments Inc. | NA | Microscope software |
Referências
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