Dette arbeidet forhåndsinnpeker en avansert protokoll for å nøyaktig vurdere tumorlasting ved påvisning av grønt fluorescerende protein og bioluminescenssignaler samt integrering av kvantitativ molekylær deteksjonsteknikk.
Trippel-negativ brystkreft (TNBC) er en aggressiv brystkreft subtype med begrensede terapeutiske alternativer. Sammenlignet med pasienter med mindre aggressive brystsvulster, er 5-års overlevelse hos TNBC-pasienter 77% på grunn av deres karakteristiske legemiddelresistente fenotype og metastatisk byrde. Mot dette formål har murinemodeller blitt etablert for å identifisere nye terapeutiske strategier som begrenser TNBC tumorvekst og metastatisk spredning. Dette arbeidet beskriver en praktisk guide for TNBC ortopisk modell der MDA-MB-231 brystkreftceller suspendert i en kjeller membran matrise er implantert i fjerde pattedyr fett pad, som nøye etterligner kreftcelle atferd hos mennesker. Måling av svulster av caliper, lungemetastasevurdering via in vivo og ex vivo imaging, og molekylær deteksjon diskuteres. Denne modellen gir en utmerket plattform for å studere terapeutisk effekt og er spesielt egnet for studiet av samspillet mellom den primære svulsten og distale metastatiske steder.
Omtrent en av åtte kvinner i USA vil utvikle invasiv brystkreft i løpet av hennes levetid, og 10% −20% av disse kvinnene vil bli diagnostisert med den aggressive trippel negative brystkreft (TNBC) undertypen. Mens primære lesjoner kan fjernes kirurgisk i de fleste tilfeller, gjør den subkliniske mikrometastasen og kjemoresistens en uopprettelig sykdom. Viktigere, de fleste pasienter med metastatisk TNBC til slutt tilbakefall, selv om de gjennomgikk behandling i tidlig stadium1. Dermed er kreftheterogenitet, mikrometastase og terapeutisk resistens tre store utfordringer som begrenser det vellykkede kliniske utfallet av TNBC-pasienter. Derfor er det et presserende behov for å bedre forstå den polymorfe molekylære bakgrunnen til TNBC og utvikle effektive terapeutiske midler som begrenser metastatisk sykdom.
Tumormetastase er en flertrinnsprosess hvor tumorcellekontrollene og utnytter mikromiljøet for å fremme sin egen formidling via membrannedbrytning og tumorcelleflukt fra den primære lesjonen, via inntreden i (dvs. intravasation) og utgang fra (dvs. ekstravasasjon) vaskulaturen, og til slutt tilpasning og kolonisering i distal vevssenger2. Dyremodeller er utviklet for å studere brystkreftmetastase, hvor to metoder ofte implementeres: direkte blodsirkulasjonsinjeksjon og ortopisk implantasjon. Vanligvis brukte metoder for direkte blodsirkulasjonsinjeksjon inkluderer haleveneinjeksjon, mens andre tilnærminger, inkludert direkte hjerteinjeksjon3,direkte hjerneinjeksjon4og direkte leverinjeksjon5, også er ansatt. Den direkte blodsirkulasjonsinjeksjonen kalles ofte en kunstig metastasemodell, som er rask og enkel, men mindre fysiologisk nøyaktig fordi den omgår tumorflukt fra den primære lesjonen og intravasation6,7,8. Sammenlignet med direkte injeksjonsmodeller tar den ortotopiske brystkreftmodellen lengre tid for forekomsten av påvisbare metastatiske lesjoner i eksterne organer som lungene, men det er mer fysiologisk relevant fordi den nøye etterligner multistep metastatisk prosess som det skjer hos mennesker. Viktigere, en 2013 studie9 sammenlignet halen vene injeksjon og ortotop modeller og fant at brystkreftcellene injisert i halen venen og de isolert fra lunge metastatiske lesjoner etter hale vene injeksjon utstilt lignende globale genuttrykk profiler. I motsetning var den globale genuttrykksprofilen til ortotopisk injiserte brystkreftceller dramatisk annerledes enn for lungemetastatiske lesjoner som følge av ortotopisk injiserte celler9. Disse observasjonene tyder på at ortopisk modellen er mer fysiologisk relevant, fordi de metastatiske lesjonene gjennomgår en utvelgelsesprosess som ligner multistepprosessen av metastase som det forekommer hos mennesker.
Dette arbeidet beskriver en ortotopisk brystkreft (MDA-MB-231-Luc/GFP) modell i nakne mus som ble optimalisert i vårt laboratorium for bildedeteksjonsteknikker, samt identifisering av nye biomarkører og utvikling av målrettede kjemoterapeutiske midler.
For studiet av TNBC hos dyr er to murinemodeller utviklet: MDA-MB-231 humane brystadenokarsinomceller hos immunkompromitterte mus (dvs. athymiske nakne mus, NSG-mus) og 4T1 i immunkompetente BALB/c-mus. Begge modellene har sine fordeler. Valget av dyremodellen for en studie avhenger av forskningsmålene. For eksempel er MDA-MB-231-modellen en menneskelig TNBC-cellelinje dyrket i immunkompromitterte mus som etterligner immunsuppresserte pasienter med brystkreft hos mennesker. På den annen side etterligner den invasive fenotypen av ortotopisk 4T1 trippelnegative murine brystkreftceller i BALB/c-mus nøye den metastatiske prosessen som det oppstår i stadium IV human brystkreftpasienter. I motsetning til intravenøs celle injeksjon tilnærming, humane MDA-MB-231 brystkreftceller ble tilsvarende injisert i bryst fett pad11,12 i ortotop brystkreft modell11,13. Jo lengre tumorvekst og ervervet metastatisk evne er mer fysiologisk relevant, og dermed er det ikke en kunstig metastatisk kreftmodell4,14. En slik spontan metastasemodell etterligner nøye menneskelig brystkreftutvikling bortsett fra initieringsstadiet. Dette er en avgjørende modell for in vivo narkotika screening og terapeutisk effektvurdering i metastatisk brystkreft.
Tumorimplantasjonsstedet i musen spiller en avgjørende rolle i å gi et mikromiljø som opprettholder tumorvekst og valg av metastatisk fenotype som ligner på det som forekommer hos mennesker. Den proksimale lymfeknuten og tilstedeværelsen av fettvev er de viktigste faktorene som påvirker sykdomsprogresjonen av brystkreft15,16. Hos en menneskelig pasient er lymfeknuten og fettvevet begge viktige interagefaktorer som påvirker maligniteten og forekomsten av brystkreft17,18,19. Dermed kan valget av riktig anatomisk plassering for injeksjonsstedet sterkt påvirke relevansen av tumormodellen sammenlignet med den menneskelige sykdommen. Denne studien brukte den fjerde brystkjertelen som implantasjonsstedet hovedsakelig på grunn av de nevnte kravene, og at det er anatomisk mer tilgjengelig og lettere å manipulere.
Ulike beregningsmetoder for tumorvolum er tilgjengelige, og en forsker kan velge hvilken som helst de passer. Algoritmen valgt for denne studien er basert på funnene av Faustino-Rocha et al., som sammenlignet forskjellige tumorvolumberegningsformler og konkluderte med at formelen nedenfor er den mest nøyaktige20.
Kjellermembranmatrise er en viktig ekstracellulær matrise som brukes i ulike in vitro21 og in vivo22,23 analyser. Det er motstridende rapporter22,24,25 om påvirkning av kjelleren membran matrise på xenograft malignitet. Det synes å bare påvirke den første etableringen av xenograft og har ingen ytterligere effekt på xenograft vekst25. For xenograft implantasjonen som er beskrevet, ble kjellermembranmatrisen blandet med kreftcellene for å øke celle/gelblandingsoppløsningenføring før implantasjon. Tilstedeværelsen av kjellermembranmatrisen reduserer tap av blandeoppløsning fra injeksjonsstedet og holder blandeløsningen på implantasjonsstedet, og øker dermed ensartetheten til det implanterte xenograftvolumet.
MDA-MB-231 cellelinjen er en ondartet udødeliggjort humanbryst adenokarsinom celle linje og er et populært verktøy i brystkreft forskning på grunn av sin trippel-negativ status. Bruken av dual reporters (luciferase og GFP) cellelinje gir mer fleksibilitet i håndteringen av in vivo og ex vivo imaging. Det er godt fastslått at bioluminescenssignalet har større følsomhet, dybdepåektelighet og overlegen kontrast (signal-til-støy-forhold) enn GFP-signaler. På grunn av dette er det en mye brukt bildemodalitet for hele kroppsavbildning. Dessverre er bioluminescensdeteksjon begrenset av et smalt tidsvindu (~15−20 min post luciferin injeksjon) der signaldeteksjonen er lineær. BLI-signalet avtar raskt når dyrene er euthanized. Dette blir et eksperimentelt designproblem hvis mange mus må euthanized og høste flere vev eller organer er nødvendig. I disse studiene ble blod høstet av direkte hjertepunktering, hjernen, primær svulst, lunge og berørt lymfeknute ble undersøkt hos 40 mus. Da organene ble høstet og klare for ex vivo-avbildning, var bioluminescenssignalet umulig å oppdage. Derfor er GFP-deteksjon mer egnet i disse situasjonene. Utslippet av GFP-signalet er i det synlige området, og ved disse bølgelengdene er signalabsorpsjon på grunn av blod (dvs. hemoglobin) betydelig høyere. Autofluorescens i det synlige området på grunn av NADH, lipo-pigmenter og flavins resulterer i en betydelig bakgrunn som gjør det vanskelig å skille mellom et lavt nivå GFP-signal og autofluorescensbakgrunn. Ved hjelp av en multispektral fluorescensavbildningstilnærming i stedet for tradisjonell filterparavbildning og bruk av spektrale unmixing-algoritmer bidrar til å identifisere ekte GFP-signal i interesseorganet. Derfor, ved å kombinere styrkene til bioluminescensavbildning i hele kroppen in vivo deteksjon og multispektral GFP-avbildning i ex vivo organ / vev evalueringer, kan kvantifiserbare data maksimeres i en stor kohort av mus.
Uansett hvilken tilnærming som er valgt for en dyrestudie, er det sterkt anbefalt å trekke ut alt blod før organ/vevsgjenfinning, spesielt for studier rettet mot den metastatiske byrden. Denne protokollen oppdager GFP-signaler fra hele blodprøver hentet fra musene (data som ikke er vist) i ortotop brystkreftmodellen av PCR-analyser i sanntid. Minimere blodvolumet i organer / vev vil redusere det falske positive signalet i målorganene.
Til slutt er ortotopbrystkreftmodellen som bruker MDA-MB-231-Luc/GFP-cellene en svært relevant dyremodell som ligner den menneskelige TNBC-pasienttilstanden nøye. Denne modellen er avgjørende for å studere, overvåke og vurdere terapeutisk effekt i et tumormikromiljø som ligner på mennesker. Bruken av dual reporter cellelinjer ytterligere forbedrer praktisk av denne ortotopiske brystkreft modellen.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å anerkjenne støtte fra Intramural Research Program av National Institutes of Health, National Cancer Institute, Bethesda MD, Cancer and Inflammation Program, og Frederick National Laboratory – Small Animal Imaging Program, Leidos Biomedical Research, Inc, Frederick Maryland, USA.
Bouins Solution | Sigma | HT10132-1L | Lung metastatic nodule staining |
D-Luciferin, Potassium Salt | GoldBio | LUCK-1G | Luciferase substrate |
DNAzol | ThermoFisher | 10503027 | DNA extraction Kit |
Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
homogenizer | Virtis | Cyclone Virtishear | For tissue homogenization |
IVIS SPECTRUM scanner | Perkin Elmer | fluorescence and BLI imaging system | |
Maestro GNIR-FLEX fluorescence scanner | Perkin Elmer | fluorescence imaging system | |
MatriGel Matrix | Corning | 356234 | Store at -20C and keep old (4 C) when in use. |
MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP Stable Cell Line | GenTarget | SC044 | Dual Reporter human breast cancer cell line |
Microscope | ThermoFisher | EVOS | histology image capture |
Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 10010049 | rinse buffer |
Primer3 | MIT | Primer Design | |
Prism | GraphPad | Statistical Analysis Software | |
Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | Antibiotics |
RPMI 1640 media | ThermoFisher | 61870127 | Culture media |
SeniFAST SYBR Lo-ROX kit | Bioline | BIO-94020 | Fast Real-Time PCR Reagent |
StepOne Plus Real-Time PCR system | ThermoFisher | Real-Time PCR machine |