לומדת משולשת סרטן השד שלילי באמצעות אורתובנושא שד סרטן השד מודל

ניתוח של גידול הגידול בוצע באמצעות פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים של המכון לסרטן הלאומי ודבק להמלצות של מועצת המחקר הלאומית של ארצות הברית “מדריך לטיפול ושימוש של בעלי חיים מעבדתיים, “המדריך לבריאות הציבור של ארצות הברית” מדריך לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה ובמדיניות הטיפול הומאני והשימוש בחיות מעבדה. 1. הכנת תאים להשתלה הערה: מד א-MB-231 האדם השד אדנוקרצינומה תאים (נרכש מסחרית) היו באופן מאוד מנוכר עם גן ללוציפראז III וחלבון פלורסנט ירוק משופר (gfp) סמן על ידי וירוס וגדל בנוכחות אנטיביוטיקה בחירה (puromycin) . התחל את תרבות התא עם 1 x 106 מד א-MB-231-לוק/gfp תאים ולהוסיף 15 מ ל של prewarmed (37 ° c) RPMI 1640 בינוני עם 10% העובר סרום (fbs) בבקבוקון תרבות T75. שמרו על התאים הגדלים בחממה לתרבית תאים בטמפרטורה מבוקרת ב-37 ° c עם 5% CO2. החלף את המדיום השלם לפחות 2x בשבוע.הערה: אל תפריע לצמיחת התאים והמשך לבדוק את התנאים הגדלים של התא מדי יום. התאים צריכים להיות תת-תרבותי כאשר הם מגיעים ל-85% הנחה של 90% לשמור על שלב ההתפשטות. שבוע לפני השתלת התא צעד, להסיר את הpuromycin מן התרבות התא בקבוקון ידי תחילה הסרת כל המדיום בבקבוקון התרבות, ולאחר מכן שטיפה 2x עם 10 מ ל של מלוחים 1x פוספט מאגור (PBS), ולבסוף להחליף את המדיום עם בינוני מלא בלי הpuromycin במהלך שלבי הוספה ושטיפה בינונית, אל תפריע לתאים. זכור לא להשתמש במדיום המלא עם האנטיביוטיקה לבחירה מעתה והלאה עבור כל שלבי חידוש המידע הבינוני. ביום הכנת התאים להשתלה, הסר את כל המדיום המלא לפני טריסיזציה כדי למנוע הפסקת הטריפסין. להוסיף 5 מ ל טריפסין לבקבוקון כדי טריזיציזציה של התאים. עקוב אחר התאים ובדוק שהם מתנתק מבקבוקון התרבות. ברגע שרוב התאים מתנתק, יש להוסיף 10 מ ל מדיום שלם כדי לנטרל את הפעילות הטריפסין. הבא, להעביר את ההשעיה התא לצינור צנטריפוגה 50 mL ו צנטריפוגה ב ~ 150 x g כדי לנקז את התאים. הסר את supernatant לאחר הצנטריפוגה ולאחר מכן להוסיף 10 מ ל של 1x PBS להשעות את התאים מחדש ולהתכונן ספירת תאים. לספור את התאים עם מונה התא ולהתאים את הריכוז של התא ל 20 x 106 תאים/mL ב הקרה 1X PBS המכיל 25% קרום המרתף מטריצה. הכנס 2 x 106 תאים ב 0.1 מ”ל 1X PBS עם 25% קרום המרתף מטריצה לתוך משטח השומן הרביעי של החלב של כל עכבר. הביאו מחטים ומזרקים נוספים עבור השתלת התא ולשמור את התא-מרתף ממברנה-מטריצה מיקס על הקרח לפני השרשה.הערה: יש מקום מת במזרק ובמחט. בהתאם לבחירת המחט ואת אורך המזרק, סוג, וגודל, מזרק טוברקולב עם 0.5 במחט של 26 גרם יכול להיות עד 70 μL שטח מת10. הכינו 40% 50% שילוב של השתלת תאים כדי לפצות על השטח המת וכל אובדן מקרי אחר. 2. אורתובנושא השד סרטן המודל ואת גודל הגידול מדידה אפשר לבני 6 שבועות עכברים עירומים athymic לתקן את המפעל לבית לפחות 1 שבוע לפני השתלת התא.הערה: שימוש בעכברים באותו גיל יקטין את וריאציית הנתונים. עבור כל סיבוב, מורדם חמישה עכברים עם isof, ב 4% עם מסוננים (0.2 μm) אוויר בקצב הזרימה של 1 L/min עבור 3-4 דקות. שים לב לקצב הנשימה של העכבר ושינוי התבנית, והשתמש בצביטה בבוהן כדי לוודא שהעכבר נמצא תחת הרדמה נכונה. ברגע שהם כבר לא זזים, להסיר עכבר אחד ומניחים חרוט האף על האף והפה עם הרדמה זהה. לנגב את בלוטתהחלב השמאלית 4 עם אלכוהול. שימוש במלקחיים שיניים משובחות, הרם את בלוטתהחלב הרביעית במקצת כדי להכניס את המחט ל -25 גרם. ודא המחט הוא משופע מעלה ולאחר מכן מעט למשוך את הבוכנה כדי לוודא את המחט לא פגע כלי דם. אם שום דם לא נכנס המזרק, להמשיך לאט להזריק 100 μL של תא מרתף-מטריקס-מטריצה מיקס לתוך משטח שומן החלב.הערה: אזור עגול ומוגבה יופיע מתחת לעור. לחכות 10-15 לאחד עבור מטריקס קרום המרתף להרדן, ולאחר מכן להסיר את המחט. חזור על התהליך עם העכברים הנותרים בתא אינדוקציה. מניחים את כל מחטים משומשים מזרקים בתיבה חדה. השתמש באותו אתר הזרקת בלוטת החלב עבור כל העכברים. שימו עין מקרוב על האתר ההזרקה ולשים לב כל מיקס השתלת תא דולף החוצה מהאתר ההזרקה.הערה: בתוך כמה דקות, העכבר יתחיל לחזור להכרה. אפשר השתלת מבע צמוח בחופשיות ללא כל הפרעה עבור 7-10 ימים לפני כל מדידת גודל הגידול. בדוק את כל העכברים עבור גודל השתל של מבע למדוד את גודל הגידול עם caliper. לקבוע את עוצמת הגידול (mm3) עם המשוואה הבאה:כאשר L הוא המימד הארוך ביותר ו-W הוא הממד הקצר ביותר בניצב ל-L. זיהוי והסרה של מיירס חורג מסטיית תקן אחת של הממוצע. להשתמש רק עכברים עם גדלים הגידול המקבילה עבור ניסויים. באופן אקראי לחלק את העכברים לקבוצות טיפול שונות ולהתחיל טיפולים. למדוד את גודל הגידול על ידי קליבר 2x בשבוע. שימו לב לכל השינויים הפיזיים של השיתלי השיתלים (כלומר, נמק, חתך). 3. בvivo יולומינציה והדמיה לשעבר vivo פלואורסצנטית הערה: במחקר זה, שני מימדים ביולומינציה והדמיה פלואורסצנטית מתנהלים בנקודת הקצה של הניסוי. הדמיה biלומינסנציה (בלי) בוצעה באמצעות סורק אופטי פרה מסחרי מצויד מצלמה מקורר של 16 סיביות ומחממים שלב הדמיה. לפני הדמיה, מורדם עד חמישה עכברים נושאת הגידול בחדר אינדוקציה על ידי הגדרת isofלאנה ב 3% עם מסוננים (0.2 μm) אוויר בקצב הזרימה של 1 L/min עבור 3-4 דקות. לקבוע הרדמה על ידי צביטה בבוהן. ודא כי התא אינדוקציה מוחזק בתוך מכסה פרקו כדי למזער את חשיפת הצוות isofלוריאן. מנהל D-לluciferin (150 מ”ג/ק”ג) לעכברים המסערים על ידי תוואי הצפק תוך שימוש במחט של 27 גר’, ולהעביר עכבר מורדם לחדר ההדמיה. בחדר ההדמיה של הסורק, יש לשמור על האיזוof, ב-2%-2.5% עם O2 כמוביל עם קצב זרימה של 1 L/min.הערה: לשמור על טמפרטורת הגוף של העכבר ב ~ 37 ° c במהלך ההליך על ידי שמירה על משטח מחומם תחת החדר אינדוקציה הרדמה, שולחן הדמיה (אם השלב אינו מחומם), ו postprocedure שחזור כלוב. לפני הדמיה של עכברי המחקר, להשיג קינטיקה לוציפראב על ידי הדמיה שלושה מרווחי גידול נוסף עכברים (בעלי חיים לא הוקצו כל קבוצות לימוד) ב 2 דקות במרווחים עבור סך של 40 מינימום באמצעות הפרמטרים הבאים: הריגוש מסנן-חסום, פליטה מסנן-פתוח, f/stop 1, FOV-D, השתמש באות הביולומינסנציה שנמדד כדי להגדיר את חלון הזמן האופטימלי לרכישת תמונה עבור כל נקודות הזמן העוקבות. בעוד ביצוע הדמיה גרורות, מגן את האות הגבוה בלי להפסיק מן הגידול העיקרי על ידי כיסוי זה עם שרוול לחתוך מתוך כפפה שחורה. לרכוש את התמונה באמצעות אותם הפרמטרים המתוארים בשלב 3.3 עם הצד הגחוני של העכבר מול המצלמה עבור הדמיה גרורות ריאה ואת הצד השני של העכבר מול המצלמה עבור הדמיה המוח גרורות.הערה: חיוני לבדוק כמה מותגים שונים של כפפות שחורות כדי לבחור את זה עם הומינסנציה אוטומטית מינימלית. באמצעות סורק ותוכנת ניתוח נתונים, לצייר אזור הצורה הסטנדרטית של עניין (ROI) על חלל בית החזה או את המוח להבטיח כי האיבר כולו מכוסה להעריך את הנטל גרורתי. לכמת את ביולומינסנציה (BL) פלט כמו שטף סה כ (פוטונים/שנייה). מיד לאחר בלי מעשה, המתת החסד העכבר באמצעות שיתוף2 חנק (כמו לפי הנחיות acuc ומוסד מאושר בעלי חיים פרוטוקולים) ולחלץ את הריאה ואת המוח עם מספריים מעכל ומלקחיים עבור לשעבר vivo הדמיה.הערה: הריאה שחולצו עבור הדמיה vivo ex ולספירת גרורות בריאות לא ניתן לבצע על אותו עכבר בשל הליכים שאינם תואמים. לשטוף במהירות את כל האיברים עם ה-PBS 1 x כדי להסיר כתמי דם שטחיים ומניחים איברים על נמוך, לוחית נמוכה, פלסטיק שחור. הובלה איברים לסורק פלואורסצנטית מרובה ספקטרלי מצויד ביכולת שאינו ניתן לערבוב (מוצק-state נוזלי גל כוונון גביש) עם מצלמת CCD 12-bit עבור זיהוי GFP. לרכוש תמונות GFP רב לגליקטרליות (מסנן עירור = 457 ± 23 ננומטר; פליטה מסנן = 490 ננומטר לעבור ארוך) של האיברים המחולצים ועכברים בקרת הנושאת לא הגידול על ידי סריקת דרך 500 למעלה 720 ננומטר בגודל שלב של 10 ננומטר. להשתמש באיברים מחוץ לגידול עכברים בקרת הנושא לתקן פלואורסצנטית אוטומטי. לאחר הדמיה של GFP רב-ספקטרלית, קבע את הגדרות ההדמיה האופטימליות. לבצע רכישת תמונה של כל אברי היעד ולבצע ניתוח תמונה (כלומר, ליצור ספרייה ספקטרלית לקבלת היפוך אוטומטי ו-GFP עבור הליך ספקטרלי הסרת ערבוב) על פי פרוטוקול של היצרן. 4. זיהוי מולקולרי של תאי סרטן שד גרורתי לאחר הדמיה vivo ex, הצמד להקפיא את כל המוח בחנקן נוזלי ולאחסן ב-80 ° c במקפיא עד מוכן לחילוץ ה-DNA. עבור חילוץ ה-DNA, לשים את כל המוח בצינור הומוגניזציה 5 מ ל עם 2 מ ל של מאגר לפירוק DNA. השתמש הומוגניזה עם הגדרת הכוח ב 50 כדי המגון לסדר את כל רקמת המוח הקפוא. לאחר רקמת המוח הוא הומוגניים לחלוטין, להעביר את ההשעיה 1 mL (lysate) כדי DNase-free ו RNase-חינם 2 mL מיקרוצנטריפוגה שפופרת ולהמשיך לבודד את ה-DNA על פי פרוטוקול של היצרן.הערה: כדי למזער את ההידבקות בזיהום DNA, נקה ביסודיות את ההומוגניצר לאחר כל מדגם על ידי שטיפה ראשונה עם 75% אתנול ב-DNase-חינם RNase-מים ללא תשלום, ואז שטיפה עם פתרון 1 M NaOH, ואחריו שטיפה עם 75% אתנול ב DNase-free ו RNase-מים ללא ביעילות להפחית ולהשמיד כל שאריות DNA. הוסף 0.5 mL של 100% אתנול של מאגר לליזה DNA לליפוסט. לערבב לדוגמה על ידי היפוך ולאחסן בטמפרטורת החדר עבור 3 דקות.הערה: אל יפוך פעמים רבות מדי או במרץ רב מדי. הדי. אנ. איי יהיה נראה. כמו מזרז צמר השתמש בעצת פיפטה כדי להעביר את ה-DNA ל-DNase טרי-free ו-RNase-ללא שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 2 מ”ל. תנו לדגימה להתייבש במשך 1 דקות. הוסיפו 1 מ”ל 75% אתנול והיפוך צינורית המיקרוצנטריפוגה 3-6x כדי לשטוף את דגימת ה-DNA. להיפטר אתנול אחרי כל כביסה על ידי ליטוף. חזור על שלב 2x של השטיפה. . האוויר מתייבש את דגימת הדי. אנ. איי בעשר ואז להוסיף 52 μL של 8 מ”מ NaOH לפזר את דגימת ה-DNA. Pipet 2 μL של דגימת ה-DNA עבור כימות ה-DNA, ולהשתמש הנותרים 50 μL עבור שיטת PCR בזמן אמת לאחר התאמת הריכוז.הערה: NaOH מסייע לפתרון מלא את דגימת ה-DNA. קוונטייט 2 μL של כל דגימת דנ א עם ספקטרוסקופיה ולהשתמש ביחס ספיגה בין A260/280 כהפניה בדיקת איכות. לחשב את הריכוז DNA עם נוסחה זו: כוונן את ריכוז ה-DNA כדי 50 ng/μL. עבור כל דגימת DNA, השתמש 50 ng של ה-DNA כתבנית ההתחלתית עבור שיטת PCR בזמן אמת. השתמש ב 8 מילימטר NaOH פתרון או DNase-חינם RNase-מים חינם כדי לדלל את דגימת ה-DNA. עיצוב זוג פריימר ספציפי חלבון האקסוגני ירוק פלואורסצנטית (GFP) רצף ב-הבית באמצעות מקור פתוח לעיצוב הפורטל האינטרנט לזיהוי PCR בזמן אמת של תג GFP בתאים גרורתי שפלשו והכובש אתרים.הערה: מחקר זה נעשה בשימוש F: 5 ‘-AGAACGGCATCAAGAC-3 ‘, R: 5 ‘-TGCTGTTGTF-3. השתמש בגיב מהיר של PCR בזמן אמת ובמכונת PCR בזמן אמת התומכת בפרוטוקול PCR בזמן אמת מהיר. בנוסף על שלבי הגברה רגילים של 30 מחזור, הוסף צעד עקומת הדיסוציאציה לסוף ההפעלה לאיתור הגברה לא ספציפית.הערה: התנאים הבאים שימשו לגילוי מולקולרי: 95 ° c התחלה חמה 2 דקות, 40 מחזורים של 95 ° צ’ 5 s, 60 ° צלזיוס 15, ולבסוף ניתוח עקומת ההיתוך. האמפר GFP הוא 135 bp בגודל. השתמש ב-DNA המוח העכבר התמים (לא השתלת תא מד א-MB-231) כשליטה שלילית. השתמש ב-DNA מופק מד א-MB-231-GFP/לוק תאים כפקד חיובי. הוסף את כל הריאגנטים של ה-PCR ללא כל תבנית DNA כאין בקרת תבנית (NTC).הערה: יש צורך בבקרת PCR עבור כל שיטת ה-PCR. 5. סרטן שד גרורות זיהוי התא בריאות עבור תת הקבוצה עכברים שנבחרו לספירה גולה גרורתית הריאה, להרדים עכברים עם isofלאנה (כמו בשלב 2.2) מיד לאחר הדמיה ex vivo, לבצע ניקוב לב עבור איסוף דם, ולאחר מכן המתת חסד על ידי פריקה צוואר הרחם. פתח את חלל החזה בעזרת מספריים מבתר וחתך את הלב והתימוס כדי לחשוף את קנה הנשימה. הכנס מזרק 10 מ ל עם מחט של 22 גרם המכיל את הפתרון של Bouin לתוך קנה הנשימה. דחפו את המזרק עד שהריאות המכווצות נפוחים ב-~ 2 מ ל של הפתרון של Bouin. להסיר את המזרק ואת המחט פעם הריאות כבר התנפח. מניחים את הריאה כולה לתוך 15 מ ל שפופרת המכילה את הפתרון של Bouin, בעדינות להפוך את הצינור כמה פעמים, ולאפשר לטבול עבור 24 h בטמפרטורת החדר. לאחר 24 שעות, להסיר את הפתרון של Bouin מהצינור, לשטוף את הריאה עם מים, ולאחר מכן למקם אותו בחזרה בצינור עם 70% אתנול. גרורות הרוזן (כתמים לבנים או גושים) על משטחי הריאות באמצעות מיקרוסקופ מבתר. 6. איסוף וניתוח נתונים הקלטת נתוני נפח הגידול, כמו גם בנתונים vivo ו לשעבר הדמיה vivo, על גיליון אלקטרוני אלקטרוני להזנת נתונים קלים, איסוף, וניהול. בסוף הניסוי, העבר את כל הנתונים לגיליון האלקטרוני האלקטרוני ולתוכנה הסטטיסטית לצורך התוויית נתונים וניתוחים סטטיסטיים.