यह काम हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन और बायोल्यूमिनेसेंस संकेतों के साथ-साथ मात्रात्मक आणविक पहचान तकनीक के एकीकरण का पता लगाकर ट्यूमर लोडिंग का सही आकलन करने के लिए एक उन्नत प्रोटोकॉल को पूर्वनिर्धारित करता है।
ट्रिपल-निगेटिव ब्रेस्ट कैंसर (टीएनबीसी) सीमित चिकित्सीय विकल्पों के साथ एक आक्रामक स्तन कैंसर उपप्रकार है। जब कम आक्रामक स्तन ट्यूमर के साथ रोगियों की तुलना में, टीएनबीसी रोगियों के 5 साल के जीवित रहने की दर ७७% उनकी विशेषता दवा प्रतिरोधी फेनोटाइप और मेटास्टैटिक बोझ के कारण है । इस छोर की ओर, murine मॉडल TNBC ट्यूमर विकास और मेटास्टैटिक प्रसार सीमित उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों की पहचान करने के उद्देश्य से स्थापित किया गया है । यह काम टीएनबीसी ऑर्थोटोपिक मॉडल के लिए एक व्यावहारिक गाइड का वर्णन करता है जहां एमडीए-एमबी-231 स्तन कैंसर कोशिकाओं को एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में निलंबित चौथे स्तन वसा पैड में प्रत्यारोपित किया जाता है, जो मनुष्यों में कैंसर सेल व्यवहार की बारीकी से नकल करता है। कैलिपर द्वारा ट्यूमर की माप, वीवो और पूर्व वीवो इमेजिंग के माध्यम से फेफड़ों के मेटास्टेसिस मूल्यांकन, और आणविक पता लगाने पर चर्चा की जाती है। यह मॉडल चिकित्सीय प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मंच प्रदान करता है और प्राथमिक ट्यूमर और डिस्टल मेटास्टैटिक साइटों के बीच बातचीत के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है।
संयुक्त राज्य अमेरिका में आठ महिलाओं में से लगभग एक अपने जीवनकाल के दौरान आक्रामक स्तन कैंसर का विकास होगा, और इन महिलाओं के 10%−20% आक्रामक ट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर (TNBC) उपप्रकार के साथ का निदान किया जाएगा । जबकि प्राथमिक घावों को शल्य चिकित्सा से ज्यादातर मामलों में हटाया जा सकता है, उपनैदानिक माइक्रोमेटास्तासिस और कीमोरेजिस्टेंस इसे एक असभ्य बीमारी बनाते हैं। महत्वपूर्ण बात, मेटास्टैटिक टीएनबीसी के साथ ज्यादातर रोगियों को अंततः पतन, भले ही वे प्रारंभिक चरण1में इलाज से गुजरना पड़ा । इस प्रकार, कैंसर विषमता, माइक्रोमेटास्टेसिस, और चिकित्सीय प्रतिरोध तीन प्रमुख टीएनबीसी रोगियों के सफल नैदानिक परिणाम को सीमित चुनौतियां हैं । इसलिए, टीएनबीसी की बहुरूपी आणविक पृष्ठभूमि को बेहतर ढंग से समझने और मेटास्टैटिक रोग को सीमित करने वाले प्रभावी चिकित्सीय एजेंटों को विकसित करने की तत्काल आवश्यकता है।
ट्यूमर मेटास्टेसिस एक मल्टीस्टेप प्रक्रिया है जहां ट्यूमर सेल अपने सूक्ष्म वातावरण को नियंत्रित करता है और प्राथमिक घाव से झिल्ली क्षरण और ट्यूमर सेल भागने के माध्यम से अपने स्वयं के प्रसार को बढ़ावा देने के लिए, में प्रवेश के माध्यम से (यानी, इंट्रावेशन) और से बाहर निकलें (यानी, विलोम) vasculature, और अंततः अनुकूलन और डिस्टल ऊतक बेड के भीतरउपनिवेशीकरण 2। स्तन कैंसर मेटास्टेसिस का अध्ययन करने के लिए पशु मॉडल विकसित किए गए हैं, जहां दो पद्धतियों को आमतौर पर लागू किया जाता है: प्रत्यक्ष रक्त परिसंचरण इंजेक्शन और ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण। प्रत्यक्ष रक्त परिसंचरण इंजेक्शन के लिए आमतौर पर नियोजित तरीकों में पूंछ नस इंजेक्शन शामिल है, जबकि प्रत्यक्ष हृदय इंजेक्शन3,प्रत्यक्ष मस्तिष्क इंजेक्शन4और प्रत्यक्ष जिगर इंजेक्शन5 सहित अन्य दृष्टिकोणों को भी नियोजित किया गया है। प्रत्यक्ष रक्त परिसंचरण इंजेक्शन को अक्सर कृत्रिम मेटाटैसिस मॉडल के रूप में जाना जाता है, जो त्वरित और आसान लेकिन कम शारीरिक रूप से सटीक होता है क्योंकि यह प्राथमिक घाव और इंट्रावेशन6,7,7,8से ट्यूमर से बचने को दरकिनार करता है। जब प्रत्यक्ष इंजेक्शन मॉडल की तुलना में, ऑर्थोटोपिक स्तन कैंसर मॉडल फेफड़ों जैसे दूरदराज के अंगों में पता लगाने योग्य मेटास्टैटिक घावों की घटना के लिए अधिक समय लेता है, लेकिन यह अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक है क्योंकि यह मनुष्यों में होने वाली मल्टीस्टेप मेटास्टैटिक प्रक्रिया की बारीकी से नकल करता है। महत्वपूर्ण बात, एक २०१३ अध्ययन9 पूंछ नस इंजेक्शन और ऑर्थोटॉपिक मॉडल की तुलना में और पाया कि स्तन कैंसर की कोशिकाओं पूंछ नस में इंजेक्शन और फेफड़ों मेटास्टैटिक घावों से अलग उन पूंछ नस इंजेक्शन के बाद इसी तरह के वैश्विक जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल का प्रदर्शन किया । इसके विपरीत, ऑर्थोटोपरिक रूप से इंजेक्ट किए गए स्तन कैंसर कोशिकाओं की वैश्विक जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल ऑर्थोटोटोपरी इंजेक्शन कोशिकाओं9से उत्पन्न होने वाले फेफड़ों के मेटास्टैटिक घावों की तुलना में नाटकीय रूप से अलग थी। इन टिप्पणियों से पता चलता है कि ऑर्थोटोपिक मॉडल अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक है, क्योंकि मेटास्टैटिक घाव मेटास्टेसिस की मल्टीस्टेप प्रक्रिया के समान चयन प्रक्रिया से गुजरते हैं जैसा कि मनुष्यों में होता है।
यह काम नग्न चूहों में एक ऑर्थोटोपिक स्तन कैंसर (एमडीए-एमबी-231-ल्यूक/जीएफपी) मॉडल का वर्णन करता है जिसे इमेजिंग डिटेक्शन तकनीकों के लिए हमारी प्रयोगशाला में अनुकूलित किया गया था और साथ ही उपन्यास बायोमार्कर की पहचान और लक्षित कीमोथेरेपी एजेंटों के विकास का वर्णन किया गया था।
जानवरों में टीएनबीसी के अध्ययन के लिए, दो मूत्र मॉडल विकसित किए गए हैं: एमडीए-एमबी-231 मानव स्तन एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाएं प्रतिरक्षा से समझौता चूहों (यानी एथिमिक न्यूड चूहों, एनएसजी चूहों) में और प्रतिरक्षा-सक्षम बीएबी/सी चूहों में 4T1। दोनों मॉडलों के अपने फायदे हैं। एक अध्ययन के लिए पशु मॉडल का चुनाव अनुसंधान लक्ष्यों पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, एमडीए-एमबी-231 मॉडल इम्यूनोसमझौता चूहों में उगाई जाने वाली एक मानव टीएनबीसी सेल लाइन है जो इम्यूनोप्रेस्ड मानव स्तन कैंसर के रोगियों की नकल करती है। दूसरी ओर, बाल्ब/सी चूहों में ऑर्थोटोपिक 4T1 ट्रिपल-निगेटिव मोनीमूत्र स्तन कैंसर कोशिकाओं का आक्रामक फेनोटाइप मेटास्टैटिक प्रक्रिया की बारीकी से नकल करता है क्योंकि यह चरण चतुर्थ मानव स्तन कैंसर के रोगियों में होता है । नसों में सेल इंजेक्शन दृष्टिकोण के विपरीत, मानव एमडीए-एमबी-231 स्तन कैंसर कोशिकाओं को इसी तरह मैममैरी फैट पैड11,,12 में ऑर्थोटोपिक स्तन कैंसर मॉडल11,,13में इंजेक्ट किया गया था। लंबे समय तक ट्यूमर की वृद्धि और अर्जित मेटास्टैटिक क्षमता अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक है, इस प्रकार यह एक कृत्रिम मेटास्टैटिक कैंसर मॉडल4,,14नहीं है। इस तरह के एक सहज मेटाटैसिस मॉडल बारीकी से दीक्षा चरण के अलावा मानव स्तन कैंसर के विकास की नकल करता है । यह मेटास्टैटिक स्तन कैंसर में वीवो ड्रग स्क्रीनिंग और चिकित्सीय प्रभावकारिता मूल्यांकन में एक महत्वपूर्ण मॉडल है।
माउस में ट्यूमर प्रत्यारोपण साइट एक माइक्रोएनवायरमेंट प्रदान करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है जो ट्यूमर के विकास को बनाए रखती है और मनुष्यों में होने वाले मेटास्टैटिक फेनोटाइप के चयन के समान है। समीपस्थ लिम्फ नोड और एडीपोस ऊतक की उपस्थिति स्तन कैंसर15,16की रोग प्रगति को प्रभावित करने वाले प्रमुख कारक हैं । एक मानव रोगी में, लिम्फ नोड और एडीपोज ऊतक दोनों प्रमुख बातचीत कारक हैं जो स्तन कैंसर17,,18,,19की द्रोह और घटनाओं को प्रभावित करते हैं। इस प्रकार, इंजेक्शन साइट के लिए सही शारीरिक स्थान का चयन मानव रोग की तुलना में ट्यूमर मॉडल की प्रासंगिकता को अत्यधिक प्रभावित कर सकता है। इस अध्ययन में मुख्य रूप से उपर्युक्त आवश्यकताओं के कारण प्रत्यारोपण साइट के रूप में चौथी स्तन ग्रंथि का उपयोग किया गया और यह शारीरिक रूप से अधिक सुलभ और हेरफेर करने में आसान है।
विभिन्न ट्यूमर मात्रा गणना विधियों उपलब्ध हैं, और एक शोधकर्ता किसी भी वे फिट देख चुन सकते हैं । इस अध्ययन के लिए चयनित एल्गोरिदम Faustino-Rocha एट अल, जो अलग ट्यूमर मात्रा गणना फार्मूले की तुलना में निष्कर्षों पर आधारित है और निष्कर्ष निकाला है कि नीचे फार्मूला सबसे सटीक20है ।
बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स एक महत्वपूर्ण बाह्य मैट्रिक्स विभिन्न इन विट्रो21 में और वीवो22,,23 परख में उपयोग किया जाता है। ज़ेनोबेड़ा द्रोह पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के प्रभाव के बारे में22,,24,,25 विरोधाभासी रिपोर्टें हैं। ऐसा लगता है कि यह केवल विद्वेष की प्रारंभिक स्थापना को प्रभावित करता है और25के विद्वेष विकास पर आगे कोई प्रभाव नहीं पड़ता है । वर्णित विद्वेष प्रत्यारोपण के लिए, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कैंसर की कोशिकाओं के साथ मिलाया गया था सेल/जेल मिश्रण समाधान चिपचिपाहट बढ़ाने के लिए प्रत्यारोपण से पहले । तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की उपस्थिति इंजेक्शन साइट से मिश्रण समाधान के नुकसान को कम कर देती है और प्रत्यारोपण साइट पर मिश्रण समाधान रखता है, इस प्रकार प्रत्यारोपित विद्वेष की मात्रा की एकरूपता को बढ़ाता है।
एमडीए-एमबी-231 सेल लाइन एक घातक अमर मानव स्तन adenocarcinoma सेल लाइन है और अपनी ट्रिपल नकारात्मक स्थिति की वजह से स्तन कैंसर अनुसंधान में एक लोकप्रिय उपकरण है। दोहरी रिपोर्टर्स (लूसिफ़ेरेज़ और जीएफपी) सेल लाइन का उपयोग वीवो और पूर्व वीवो इमेजिंग में हैंडलिंग में अधिक लचीलापन की अनुमति देता है। यह अच्छी तरह से स्थापित है कि बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नल में जीएफपी संकेतों की तुलना में अधिक संवेदनशीलता, गहराई से पता लगाने की क्षमता और बेहतर विपरीत (सिग्नल-टू-शोर अनुपात) है। इस वजह से, यह पूरे शरीर इमेजिंग के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल इमेजिंग तौर-तरीके है। दुर्भाग्य से, बायोल्यूमिनेसेंस डिटेक्शन एक संकीर्ण समय खिड़की (~ 15−20 मिनट पोस्ट लूसिफ़ेरिन इंजेक्शन) द्वारा सीमित है जिसके दौरान सिग्नल डिटेक्शन रैखिक है। BLI संकेत तेजी से घटता है जब जानवरों इच्छामृत्यु कर रहे हैं । यह एक प्रयोगात्मक डिजाइन मुद्दा बन जाता है यदि कई चूहों को इच्छामृत्यु और कई ऊतकों या अंगों की कटाई की आवश्यकता होती है। इन अध्ययनों में, रक्त प्रत्यक्ष दिल पंचर, मस्तिष्क, प्राथमिक ट्यूमर, फेफड़े, और प्रभावित लिम्फ नोड द्वारा काटा गया था ४० चूहों में जांच की गई । जब तक अंगों को काटा गया और पूर्व वीवो इमेजिंग के लिए तैयार किया गया, बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नल अज्ञेय था। इसलिए, इन स्थितियों में जीएफपी का पता लगाना अधिक उपयुक्त है। जीएफपी सिग्नल का उत्सर्जन दृश्यमान रेंज में है, और इन तरंगदैर्ध्य में, रक्त (यानी हीमोग्लोबिन) के कारण सिग्नल अवशोषण काफी अधिक है। इसके अलावा, NADH, लिपो-पिगमेंट और फ्लेविन के कारण दिखाई देने वाली सीमा में ऑटोफ्लोरेसेंस एक महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि में परिणाम देता है जो निम्न स्तर के जीएफपी सिग्नल और ऑटोफ्लोरेसेंस पृष्ठभूमि के बीच अंतर करना मुश्किल बनाता है। पारंपरिक फिल्टर-जोड़ी इमेजिंग के बजाय एक बहुस्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस इमेजिंग दृष्टिकोण को नियोजित करना और स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग एल्गोरिदम का उपयोग करने से ब्याज के अंग में सच्चे जीएफपी सिग्नल की पहचान करने में मदद मिलती है। इसलिए, पूर्व वीवो अंग/ऊतक मूल्यांकनों में वीवो डिटेक्शन और मल्टीस्पेक्ट्रल जीएफपी इमेजिंग में पूरे शरीर में बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग की ताकत के संयोजन से, चूहों की एक बड़ी पलटन में मात्रात्मक डेटा को अधिकतम किया जा सकता है ।
कोई फर्क नहीं पड़ता कि पशु अध्ययन के लिए किस दृष्टिकोण का चयन किया जाता है, अंग/ऊतक पुनर्प्राप्ति से पहले सभी रक्त निकालने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है, विशेष रूप से मेटास्टैटिक बोझ को लक्षित करने वाले अध्ययनों के लिए । यह प्रोटोकॉल वास्तविक समय पीसीआर assays द्वारा ऑर्थोटोपिक स्तन कैंसर मॉडल में चूहों (नहीं दिखाए गए डेटा) से प्राप्त पूरे रक्त नमूनों से GFP संकेतों का पता लगाता है। अंगों/ऊतकों में रक्त की मात्रा को कम करने से लक्षित अंगों में झूठे सकारात्मक संकेत कम हो जाएंगे ।
निष्कर्ष में, एमडीए-एमबी-२३१-ल्यूक/जीएफपी कोशिकाओं का उपयोग करके ऑर्थोटोपिक स्तन कैंसर मॉडल एक अत्यधिक प्रासंगिक पशु मॉडल है जो मानव टीएनबीसी रोगी की स्थिति की बारीकी से नकल करता है । यह मॉडल मनुष्यों के समान ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट में चिकित्सीय प्रभावकारिता का अध्ययन, निगरानी और आकलन करने के लिए आवश्यक है। ड्यूल रिपोर्टर सेल लाइनों का इस्तेमाल इस ऑर्थोटोपिक ब्रेस्ट कैंसर मॉडल की व्यावहारिकता को और बढ़ाता है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों, राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, बेथेस्डा एमडी, कैंसर और सूजन कार्यक्रम, और फ्रेडरिक नेशनल लेबोरेटरी – छोटे पशु इमेजिंग कार्यक्रम के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं, लीडोस बायोमेडिकल रिसर्च, इंक, फ्रेडरिक मैरीलैंड, यूएसए।
Bouins Solution | Sigma | HT10132-1L | Lung metastatic nodule staining |
D-Luciferin, Potassium Salt | GoldBio | LUCK-1G | Luciferase substrate |
DNAzol | ThermoFisher | 10503027 | DNA extraction Kit |
Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
homogenizer | Virtis | Cyclone Virtishear | For tissue homogenization |
IVIS SPECTRUM scanner | Perkin Elmer | fluorescence and BLI imaging system | |
Maestro GNIR-FLEX fluorescence scanner | Perkin Elmer | fluorescence imaging system | |
MatriGel Matrix | Corning | 356234 | Store at -20C and keep old (4 C) when in use. |
MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP Stable Cell Line | GenTarget | SC044 | Dual Reporter human breast cancer cell line |
Microscope | ThermoFisher | EVOS | histology image capture |
Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 10010049 | rinse buffer |
Primer3 | MIT | Primer Design | |
Prism | GraphPad | Statistical Analysis Software | |
Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | Antibiotics |
RPMI 1640 media | ThermoFisher | 61870127 | Culture media |
SeniFAST SYBR Lo-ROX kit | Bioline | BIO-94020 | Fast Real-Time PCR Reagent |
StepOne Plus Real-Time PCR system | ThermoFisher | Real-Time PCR machine |