Summary

Un protocolo basado en FACS para aislar el ARN de las células secundarias de Drosophila Male Accessory Glands

Published: September 05, 2019
doi:

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para disociar y ordenar una población celular específica de las glándulas accesorias masculinas Drosophila (células secundarias) para la secuenciación de ARN y RT-qPCR. El aislamiento celular se logra a través de la purificación FACS de células secundarias que expresan GFP después de un proceso de disociación de múltiples pasos que requiere disección, digestión de proteasas y dispersión mecánica.

Abstract

Para entender la función de un órgano, a menudo es útil entender el papel de sus poblaciones celulares constituyentes. Desafortunadamente, la rareza de las poblaciones celulares individuales a menudo hace que sea difícil obtener suficiente material para estudios moleculares. Por ejemplo, la glándula accesoria del sistema reproductor masculino Drosophila contiene dos tipos distintos de células secretoras. Las células principales conforman el 96% de las células secretoras de la glándula, mientras que las células secundarias (SC) conforman el 4% restante de las células (alrededor de 80 células por macho). Aunque ambos tipos de células producen componentes importantes del líquido seminal, sólo unos pocos genes son conocidos por ser específicos de los SC. La rareza de los SC ha obstaculizado hasta ahora el estudio del análisis transcriptomico de este importante tipo de célula. Aquí, se presenta un método que permite la purificación de SC s c. para la extracción y secuenciación de ARN. El protocolo consiste primero en disección de glándulas de moscas que expresan un reportero de PfP específico de SC y luego sometiendo estas glándulas a digestión proteasa y disociación mecánica para obtener células individuales. Siguiendo estos pasos, las células individuales, vivas, marcadas con GFP se clasifican utilizando un clasificador de células activado sfluorescentes (FACS) para la purificación del ARN. Este procedimiento produce ARN específicos de SC de 40 machos por condición para la secuenciación de RT-qPCR y/o ARN aguas abajo en el transcurso de un día. La rapidez y simplicidad del procedimiento permite determinar en un corto período de tiempo los transcriptomas de muchas moscas diferentes, de diferentes genotipos o condiciones ambientales.

Introduction

Los órganos se componen de múltiples tipos de células, cada una con funciones discretas y a veces expresando conjuntos muy diferentes de genes. Para obtener una comprensión precisa de cómo funciona un órgano, a menudo es fundamental estudiar cada tipo de célula distinta que compone este órgano. Uno de los métodos principales utilizados para explorar la posible función es el análisis del transcriptoma. Este potente método proporciona una instantánea de la expresión génica en una célula, para revelar los procesos y vías activas. Sin embargo, este tipo de análisis es a menudo difícil para las poblaciones de células raras que deben ser purificadas a partir de células vecinas mucho más abundantes. Por ejemplo, la glándula accesoria masculina Drosophila es un órgano compuesto principalmente de dos tipos de células secretoras. Como el más raro de los dos tipos de células comprende sólo el 4% de las células de esta glándula, el uso de un análisis de transcriptoma específico de tipo celular no se había utilizado para ayudar a determinar la función de estas células.

Las glándulas accesorias (AG) son órganos del tracto reproductivo masculino en insectos. Son responsables de la producción de la mayoría de las proteínas del líquido seminal (proteínas de líquido seminal (SFP) y proteínas de la glándula accesoria (ACL)). Algunos de estos SFP son conocidos por inducir las respuestas fisiológicas y conductuales en las hembras apareadas, comúnmente llamada la respuesta post-acoplamiento (PMR). Algunos de los PMR incluyen: un aumento de la ovulación y la tasa de puesta de óvulos, el almacenamiento y liberación de espermatozoides, un cambio en la dieta femenina, y una disminución en la receptividad femenina a los varones de cortejo secundario1,2. Dado que los insectos afectan a muchas de las principales cuestiones sociales, desde la salud humana (como vectores de enfermedades mortales) hasta la agricultura (los insectos pueden ser plagas, pero son críticos para la polinización y la calidad del suelo), la comprensión de la reproducción de insectos es un área importante de investigación. El estudio de los AG y los ACP se ha avanzado significativamente con el organismo modelo Drosophila melanogaster. Estos estudios han puesto de relieve el papel de los AG y algunas de las proteínas individuales que producen en la creación del PMR, impactando el trabajo en otras especies como el vector de la enfermedad Aedes aegypti3,4,y otros insectos1 ,5. Además, como los aGs secretan los componentes del fluido seminal1,6 son a menudo considerados como el análogo funcional de la glándula prostática de mamíferos y la vesícula seminal. Esta similitud de función combinada con similitudes moleculares entre los dos tipos de tejido, han hecho de los AG un modelo para la glándula prostática en moscas7.

Dentro del macho Drosophila, hay dos lóbulos de glándulas accesorias. Cada lóbulo puede ser visto como una estructura similar a un saco compuesto por una monocapa de células secretoras que rodean un lumen central, y envuelto por músculos lisos. Como se mencionó anteriormente, hay dos tipos de células secretoras morfológica, de desarrollo y funcionalmente distintas que componen esta glándula: las células principales en forma poligonal (que componen el 96% de las células), y las células secundarias redondas (SC) más grandes (que componen el 4% restante de las células, o alrededor de 40 células por lóbulo). Se ha demostrado que ambos tipos de celda producen conjuntos distintos de ACL para inducir y mantener el PMR. La mayoría de los datos obtenidos hasta la fecha destacan el papel de una sola proteína en la activación de la mayoría de los comportamientos característicos de la PMR. Esta proteína, el péptido sexual, es un pequeño péptido de 36 aminoácidos que es secretado por las células principales8,9,10. Aunque el péptido sexual parece desempeñar un papel importante en el PMR, otros ACP, producidos por las células principales y secundarias, también han demostrado afectar a varios aspectos de la PMR11,12,13,14 ,15,16,17. Por ejemplo, sobre la base de nuestros conocimientos actuales, los SC, a través de las proteínas que producen, parecen ser necesarios para la perpetuación de la señalización SP después del primer día18.

Dada la rareza de los SC (sólo 80 células por macho), todo nuestro conocimiento sobre estas células y las proteínas que producen proviene de la genética y los enfoques candidatos. Hasta ahora, sólo se ha demostrado que una lista relativamente pequeña de genes es específica de SC. Esta lista incluye la proteína homeodominio Proventriculus defectuoso (Dve)19, el lncRNA MSA20, Rab6, 7, 11 y 1921, CG1656 y CG1757511, 15,21 y el factor de transcripción homeobox Abdominal-B (Abd-B)18. Anteriormente, hemos demostrado que un mutante deficiente tanto para la expresión de Abd-B como para el LncRNA MSA en células secundarias(iab-6cocuD1 mutante) acorta la longitud de la PMR de 10 días a solo un día12 , 18 , 20. Este fenotipo parece ser causado por el almacenamiento inadecuado de SP en el tracto reproductivo femenino12,18,20. A nivel celular, las células secundarias de este mutante muestran morfología anormal, perdiendo sus características estructuras similares a la vacuola18,20,21. Usando esta línea mutante, previamente intentamos identificar los genes involucrados en la función SC comparando los perfiles transcripcionales de los aGenteros de tipo salvaje o glándulas accesorias mutantes12. Además, otros laboratorios mostraron que el número de SC, la morfología y el contenido vacuolar dependen de la dieta masculina, el estado de apareamiento y la edad21,25,26.

Aunque se lograron progresos positivos utilizando estos enfoques, un transcriptoma completo de SC dista mucho de lograrse. La rareza de estas células en este órgano hizo difícil progresar aún más incluso desde células de tipo salvaje. Para probar la expresión génica, los cambios en estas células después de estímulos ambientales particulares serían aún más difíciles. Por lo tanto, se necesitaba un método para aislar y purificar el ARN SC que fuera lo suficientemente rápido y simple como para funcionar bajo diferentes orígenes genéticos y condiciones ambientales.

Tanto los genes Abd-B como MSA requieren un potenciador específico de 1,1 kb del Complejo Drosophila Bithorax (llamado potenciador D1) para su expresión en SCs18,20. Este potenciador se ha utilizado anteriormente para crear un controlador GAL4 que, cuando se asocia con un UAS-GFP,es capaz de impulsar la expresión GFP fuerte específicamente en SCs. Por lo tanto, usamos esta línea como base para un protocolo FACS para aislar estas células del tipo salvaje y del iab-6cocuD1 AG). Como los SC mutantes iab-6cocuD1 muestran una morfología celular diferente, mostramos que este protocolo se puede utilizar para aislar las células para la determinación de su transcriptoma de este tipo de célula rara en condiciones muy diferentes.

Protocol

1. Líneas de Drosophila Utilizadas y Colección de Hombres Para este protocolo, utilice machos que expresen GFP en los SC y no en las células principales. Aquí, se utiliza un controlador AbdB-GAL4 (descrito en la referencia18),recombinado con UAS-GFP (en el cromosoma 2). También se pueden utilizar otros controladores apropiados. Para el aislamiento de SC sbajo diferentes condiciones mutantes, cruce la mutación en líneas que contengan la línea GFP especí…

Representative Results

El protocolo presentado aquí permite a un experimentador aislar las células secundarias de las glándulas accesorias masculinas Drosophila y extraer su ARN en el transcurso de un solo día(Figura 1). Usamos la construcción Abd-B-GAL4 18 para etiquetar las células secundarias (SC) pero no las células principales (MC) con GFP(Figura 2…

Discussion

Los métodos para la disociación celular del tejido Drosophila como los discos imaginativos ya se describen23. Nuestros intentos de simplemente utilizar estos procedimientos en las glándulas accesorias fracasaron, animándonos a desarrollar este nuevo protocolo. La digestión de la proteasa y la trituración mecánica fueron pasos críticos que tenemos problemas para el éxito del procedimiento, y por lo tanto colocamos muchas notas en las secciones 2 a 5 para ayudar a los experimentado…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a los miembros del laboratorio de Karch, a la forma de placa de genómica iGE3, a las instalaciones centrales de Flow Cytometry de la Universidad de Ginebra y al Dr. Jean-Pierre Aubry-Lachainaye, que estableció el protocolo para FACS. Agradecemos a Luca Stickley por su ayuda para visualizar las lecturas en IGV. Nos damos las gracias por el permiso suave para reutilizar figuras, y a los editores por incitarnos a ser creativos con la escritura.

Esta investigación fue financiada por el Estado de Ginebra (CI, RKM, FK), el Fondo Nacional Suizo de Investigación (www.snf.ch) (FK y RKM) y donaciones de la Fundación Claraz (FK).

Materials

24-wells Tissue Culture plate VWR 734-2325
Binocular microscope for dissection
Binocular with light source for GFP
Bunsen
Draq7 0.3 mM BioStatus DR71000
Plastic microtubes 1.5 mL Eppendorf
FACS Beckman Coulter MoFlo Astrios
Fine dissection forceps
Foetal bovine serum Gibco 10270-106 heat inactivated prior to use
Glass dishes for dissection
Ice bucket
ImProm-II Reverse Transcription System Promega A3800
MasterPure RNA Purification Kit Epicentre MCR85102
Nextera XT kit illumina https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html
P1000 Gilson
P20 Gilson
P200 Gilson
Papain 50U/mL stock
PBS home made
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063
PolydT primers
Random hexamer primers
RNA 6000 Pico kit Agilent
Schneider’s Drosophila medium Gibco 21720-001
SMARTer cDNA synthesis kit Takara https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits
SYBR select Master mix for CFX applied biosystems 4472942
Thermo Shaker Hangzhou Allsheng intruments MS-100
Tipone 1250 μl graduated tip Starlab S1161-1820
Tipone 200 μl bevelled tip Starlab S1161-1800
TrypLE Express Enzyme Gibco 12604013
Vortex

Referências

  1. Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annual Review of Entomology. 56, 21-40 (2011).
  2. Carmel, I., Tram, U., Heifetz, Y. Mating induces developmental changes in the insect female reproductive tract. Current Opinion in Insect Science. 13, 106-113 (2016).
  3. League, G. P., Baxter, L. L., Wolfner, M. F., Harrington, L. C. Male accessory gland molecules inhibit harmonic convergence in the mosquito Aedes aegypti. Current Biology. 29 (6), R196-R197 (2019).
  4. Degner, E. C., et al. Proteins, Transcripts, and Genetic Architecture of Seminal Fluid and Sperm in the Mosquito Aedes aegypti. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (Suppl 1), S6-S22 (2019).
  5. Wedell, N. Female receptivity in butterflies and moths. Journal of Experimental Biology. 208 (Pt 18), 3433-3440 (2005).
  6. Laflamme, B. A., Wolfner, M. F. Identification and function of proteolysis regulators in seminal fluid. Molecular Reproduction and Development. 80 (2), 80-101 (2013).
  7. Wilson, C., Leiblich, A., Goberdhan, D. C., Hamdy, F. The Drosophila Accessory Gland as a Model for Prostate Cancer and Other Pathologies. Current Topics in Developmental Biology. 121, 339-375 (2017).
  8. Kubli, E., Bopp, D. Sexual behavior: how Sex Peptide flips the postmating switch of female flies. Current Biology. 22 (13), R520-R522 (2012).
  9. Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (8), 1689-1704 (2003).
  10. Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (17), 9929-9933 (2003).
  11. Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid proteins. PLoS Genetics. 3 (12), e238 (2007).
  12. Sitnik, J. L., Gligorov, D., Maeda, R. K., Karch, F., Wolfner, M. F. The Female Post-Mating Response Requires Genes Expressed in the Secondary Cells of the Male Accessory Gland in Drosophila melanogaster. Genética. 202 (3), 1029-1041 (2016).
  13. Avila, F. W., Wolfner, M. F. Acp36DE is required for uterine conformational changes in mated Drosophila females. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15796-15800 (2009).
  14. Adams, E. M., Wolfner, M. F. Seminal proteins but not sperm induce morphological changes in the Drosophila melanogaster female reproductive tract during sperm storage. Journal of Insect Physiology. 53 (4), 319-331 (2007).
  15. Singh, A., et al. Long-term interaction between Drosophila sperm and sex peptide is mediated by other seminal proteins that bind only transiently to sperm. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 102, 43-51 (2018).
  16. Avila, F. W., Wolfner, M. F. Cleavage of the Drosophila seminal protein Acp36DE in mated females enhances its sperm storage activity. Journal of Insect Physiology. 101, 66-72 (2017).
  17. Chapman, T., Davies, S. J. Functions and analysis of the seminal fluid proteins of male Drosophila melanogaster fruit flies. Peptides. 25 (9), 1477-1490 (2004).
  18. Gligorov, D., Sitnik, J. L., Maeda, R. K., Wolfner, M. F., Karch, F. A novel function for the Hox gene Abd-B in the male accessory gland regulates the long-term female post-mating response in Drosophila. PLoS Genetics. 9 (3), e1003395 (2013).
  19. Minami, R., et al. The homeodomain protein defective proventriculus is essential for male accessory gland development to enhance fecundity in Drosophila. PLoS One. 7 (3), e32302 (2012).
  20. Maeda, R. K., et al. The lncRNA male-specific abdominal plays a critical role in Drosophila accessory gland development and male fertility. PLoS Genetics. 14 (7), e1007519 (2018).
  21. Prince, E., et al. Rab-mediated trafficking in the secondary cells of Drosophila male accessory glands and its role in fecundity. Traffic. 20 (2), 137-151 (2019).
  22. Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
  23. Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
  24. Corrigan, L., et al. BMP-regulated exosomes from Drosophila male reproductive glands reprogram female behavior. Journal of Cell Biology. 206 (5), 671-688 (2014).
  25. Leiblich, A., et al. Bone morphogenetic protein- and mating-dependent secretory cell growth and migration in the Drosophila accessory gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19292-19297 (2012).
  26. Kubo, A., et al. Nutrient conditions sensed by the reproductive organ during development optimize male fecundity in Drosophila. Genes to Cells. 23 (7), 557-567 (2018).
  27. Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. FACS-based isolation and RNA extraction of Secondary Cells from the Drosophila male Accessory Gland. bioRxiv. , 630335 (2019).

Play Video

Citar este artigo
Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands. J. Vis. Exp. (151), e60218, doi:10.3791/60218 (2019).

View Video