بروتوكول يستند إلى FACS لعزل الحمض النووي الريبي من الخلايا الثانوية للغدد التبعي الذكور Drosophila

تتكون الأعضاء من أنواع خلايا متعددة، لكل منها وظائف منفصلة وتعبر في بعض الأحيان عن مجموعات مختلفة إلى حد كبير من الجينات. للحصول على فهم دقيق لكيفية عمل الجهاز، غالباً ما يكون من الضروري دراسة كل نوع خلية متميزة التي تشكل هذا الجهاز. واحدة من الطرق الأساسية المستخدمة لاستكشاف وظيفة ممكنة هو تحليل النسخ. توفر هذه الطريقة القوية لقطة من التعبير الجيني في الخلية، للكشف عن العمليات والمسارات النشطة. ومع ذلك، هذا النوع من التحليل غالباً ما يكون من الصعب على مجموعات الخلايا النادرة التي يجب تنقيتها من الخلايا المجاورة أكثر وفرة بكثير. على سبيل المثال، الغدة التبعية الذكور دروسوفيلا هو جهاز تتكون في المقام الأول من نوعين من الخلايا السرية. وبما أن أندر من نوعي الخلايا لا يشكل سوى 4٪ من خلايا هذه الغدة، لم يتم استخدام تحليل النسخ من نوع الخلية المحددة للمساعدة في تحديد وظيفة هذه الخلايا.

الغدد التبعي (AGs) هي أجهزة الجهاز التناسلي الذكور في الحشرات. وهي مسؤولة عن إنتاج معظم بروتينات السائل المنوي (بروتينات السوائل المنوية (SFPs) وبروتينات الغدة التبعي (ACPs)). ومن المعروف أن بعض هذه SFPs للحث على الاستجابات الفسيولوجية والسلوكية في الإناث التزاوج، وتسمى عادة استجابة ما بعد التزاوج (PMR). وتشمل بعض PMRs: زيادة معدل الإباضة ووضع البيض، وتخزين والإفراج عن الحيوانات المنوية، وتغيير في النظام الغذائي للإناث، وانخفاض في تقبل الإناث إلى الذكور التودد الثانوي^1،2. وبما أن الحشرات تؤثر على العديد من القضايا المجتمعية الرئيسية من الصحة البشرية (كناقلات للأمراض الفتاكة) إلى الزراعة (يمكن أن تكون الحشرات آفات، ومع ذلك فهي حاسمة بالنسبة للتلقيح ونوعية التربة)، فإن فهم تكاثر الحشرات هو مجال هام من مجالات البحث. وقد تقدمت دراسة AGs وACPs بشكل ملحوظ مع الكائن الحي النموذجي Drosophila melanogaster. وقد أبرزت هذه الدراسات دور AGs وبعض البروتينات الفردية التي تنتجها في خلق PMR، مما يؤثر على العمل في الأنواع الأخرى مثل ناقلات المرض Aedes aegypti^3،4، وغيرها من الحشرات^{1 ،5}. وعلاوة على ذلك، كما تفرز AGs مكونات السائل المنوي^1،6 وغالبا ما يعتقد أنها التناظرية الوظيفية للغدة البروستاتا الثدييات والحويصلة المنوية. هذا التشابه وظيفة جنبا إلى جنب مع أوجه التشابه الجزيئي بين اثنين من أنواع الأنسجة، جعلت من AGs نموذجا للغدة البروستاتا في الذباب⁷.

داخل الذكور دروسوفيلا، وهناك اثنين من الفصوص من الغدد التبعي. يمكن النظر إلى كل فص على أنه هيكل يشبه الكيس يتكون من طبقة أحادية من الخلايا السرية المحيطة بالتجويف المركزي، وملفوفة بعضلات ناعمة. كما ذكر أعلاه، هناك نوعان من الخلايا السرية المورفولوجية والتنموية والمتميزة وظيفيا ً التي تشكل هذه الغدة: الخلايا الرئيسية على شكل مضلع (تشكل حوالي 96٪ من الخلايا)، والخلايا الثانوية المستديرة الأكبر (SC) (تشكل 4٪ المتبقية من الخلايا، أو حوالي 40 خلية لكل فص). وقد تبين أن كلا النوعين من الخلايا ينتجان مجموعات متميزة من الـ ACPs للحث على وجود التصوير بالرنين المغناطيسي والحفاظ عليه. معظم البيانات التي تم الحصول عليها حتى الآن تسليط الضوء على دور بروتين واحد في إثارة معظم السلوكيات المميزة للPMR. هذا البروتين، الببتيد الجنس، هو صغير، 36 الببتيد الأحماض الأمينية التي تفرزها الخلايا الرئيسية^8،9،10. على الرغم من أن الببتيد الجنس يبدو أن تلعب دورا رئيسيا في PMR، ACPs الأخرى، التي تنتجها كل من الخلايا الرئيسية والثانوية، كما تبين أن تؤثر على جوانب مختلفة من PMR^{11،12،13،14 ،15،16،17}. على سبيل المثال، استنادا إلى معرفتنا الحالية، يبدو أن SCs، عن طريق البروتينات التي تنتجها، مطلوبة لإدامة إشارة SP بعد اليوم الأول¹⁸.

وبالنظر إلى ندرة SCs (80 خلية فقط لكل ذكر)، فإن كل معرفتنا بهذه الخلايا والبروتينات التي تنتجها تأتي من علم الوراثة ونهج المرشح. وحتى الآن، لم يُثبت سوى قائمة صغيرة نسبياً من الجينات أنها خاصة بشركة SC. وتشمل هذه القائمة البروتين homeodomain المعيبة proventriculus (Dve)¹⁹, وlncRNA MSA²⁰, Rab6, 7, 11 و 19²¹, CG1656 و CG17575^{11, 15،21} وعامل النسخ homeobox البطن-B (عبد الب)¹⁸. في السابق، أظهرنا أن متحولة ناقصة لكل من التعبير عن عبد الب وMSA lncRNA في الخلايا الثانوية(iab-6^cocuD1 متحولة) تقصير طول PMR من ~ 10 أيام إلى يوم واحد فقط^{12 , 18 سنة , 20.}ويبدو أن هذا النمط الظاهري هو سبب التخزين غير السليم من SP في الجهاز التناسلي الأنثوي^12,18,20. على المستوى الخلوي، تظهر الخلايا الثانوية لهذا المتحولمورولوجيا غير طبيعية، وفقدان هياكلها المميزة مثل الفراغول^18،20،21. باستخدام هذا الخط متحولة، حاولنا سابقا لتحديد الجينات المشاركة في وظيفة SC عن طريق مقارنة ملامح النسخ من AGs كله من نوع البرية أو الغدد التبعي متحولة¹². أيضا، وأظهرت مختبرات أخرى أن عدد SC، مورفولوجيا ومحتوى vacuolar تعتمد على النظام الغذائي الذكور، وحالة التزاوج والعمر^21،25،26.

وعلى الرغم من إحراز تقدم إيجابي باستخدام هذه النهج، فإن نسخة كاملة من اللجنة لم تتحقق بعد. ندرة هذه الخلايا في هذا الجهاز جعلت من الصعب التقدم أكثر حتى من خلايا النوع البرية. لاختبار التعبير الجيني، فإن التغيرات في هذه الخلايا بعد محفزات بيئية معينة ستكون أكثر صعوبة. وهكذا، هناك حاجة إلى طريقة لعزل وتنقية الحمض النووي الريبي SC التي كانت سريعة وبسيطة بما فيه الكفاية لأداء في ظل خلفيات وراثية مختلفة والظروف البيئية.

كل من الجينات عبد-B وMSA تتطلب محسن 1.1 كيلو بايت محددة من مجمع Drosophila Bithorax (يسمى محسن D1) للتعبير عنها في SCs^18,20. وقد تم استخدام هذا محسن سابقا لإنشاء برنامج تشغيل GAL4 التي، عند ربطها UAS-GFP،قادرة على دفع تعبير GFP قوية على وجه التحديد في SCs. وهكذا، استخدمنا هذا الخط كأساس لبروتوكول FACS لعزل هذه الخلايا من كل من النوع البري وiab-6^cocuD1 AGs). كما iab-6^{cocuD1 متحولة SCuD1} عرض مورفولوجيا الخلوية المختلفة، ونحن نظهر أن هذا البروتوكول يمكن استخدامها لعزل الخلايا لتحديد النسخ من هذا النوع من الخلايا النادرة في ظل ظروف مختلفة إلى حد كبير.