このプロトコルは、自由に動くマウスの2つの脳領域に9つの独立して調節可能なテトロデスと1つの調節可能な光シリコンプローブの移植を可能にするハイブリッドマイクロドライブアレイの構築について説明する。また、オプトシリコンプローブを複数の目的で安全に回収・再利用する方法も実証されています。
多地域の神経記録は、複数の脳領域間の微細な時間スケールの相互作用を理解するために重要な情報を提供することができます。しかし、従来のマイクロドライブ設計では、単一または複数の領域から記録する電極の1種類のみを使用することが可能で、単一ユニットまたは深度プロファイル記録の収率が制限されます。また、多くの場合、電極記録と光遺伝学的ツールを組み合わせて経路や細胞タイプの特定の活性を標的にする機能を制限します。ここでは、収量を最適化するためにマウスを自由に移動するためのハイブリッドマイクロドライブアレイと、マイクロドライブアレイの製造と再利用の説明を示します。現在の設計は自由に動くマウスで同時に2つの異なった脳区域に埋め込まれる9つのテトロデスおよび1つのオプトシリコンの調査を採用する。テトロデスおよび光シリコンプローブは、ユニットおよび振動活性の収率を最大化するために、脳内の背筋軸に沿って独立して調整可能です。このマイクロドライブアレイには、光のセットアップが組み込まれ、光遺伝学的操作を媒次化して、長距離神経回路の局所または細胞型固有の応答と機能を調べることもできます。さらに、オプトシリコンプローブは、各実験後に安全に回収し、再利用することができます。マイクロドライブアレイは3Dプリント部品で構成されているため、様々な設定に合わせてマイクロドライブの設計を簡単に変更できます。最初に説明したマイクロドライブアレイの設計と光遺伝学実験用のシリコンプローブに光ファイバを取り付ける方法、続いてテトロードバンドルの製造とアレイのマウス脳への移植方法について説明します。光遺伝学的刺激と組み合わせた局所視野電位とユニットスパイクの記録はまた、自由に動くマウスにおけるマイクロドライブアレイシステムの実現可能性を実証する。
ニューロン活動が学習や記憶などの認知プロセスをどのようにサポートしているかを理解することは、異なる脳領域が動的にどのように相互作用するかを調べていくうえで重要です。認知タスクの根底にある神経活動のダイナミクスを解明するために、マイクロドライブアレイ1、2、3、の助けを借りて自由に動く動物において、大規模な細胞外電気生理学が行われてきた。 4.過去20年間で、いくつかのタイプのマイクロドライブアレイは、ラット5、6、7、8およびマウス9の複数の脳領域に電極を移植するために開発された。10歳,11歳,12.それにもかかわらず、現在のマイクロドライブの設計は、一般的に複数のプローブタイプの使用を許可していない、研究者は、特定の利点と制限を持つ単一の電極タイプを選択することを余儀なくされています。例えば、テトロード配列は、後部海馬CA11、13などの人口密度の高い脳領域に適していますが、シリコンプローブは解剖学的接続を研究するためのより良い幾何学的プロファイルを与えます14 ,15.
テトロデスとシリコンプローブは、多くの場合、生体内慢性記録に使用され、それぞれが独自の長所と短所を持っています。テトロデスは、費用対効果と機械的剛性に加えて、単一の電極16、17よりも優れた単一ユニット絶縁で重要な利点を有することが証明されています。彼らはまた、マイクロドライブ8、18、19、20と組み合わせると、単一ユニット活動のより高い収率を提供します。神経回路21の機能を理解するために同時に記録されたニューロンの数を増やすることが不可欠である。例えば、時間関連の22細胞や報酬コーディング23細胞などの機能的に異種細胞タイプの小さな集団を調査するためには、多数の細胞が必要である。スパイクシーケンス13、24、25のデコード品質を向上させるためには、はるかに高いセル番号が必要です。
しかし、テトロデスは、皮質や視床など、空間的に分布する細胞を記録する上で欠点がある。テトロデスとは対照的に、シリコンプローブは、局所的な電界電位(LFP)の空間分布および相互作用を提供し、局所構造14,26内のスパイク活動を提供することができる。マルチシャンクシリコンプローブは、記録部数をさらに増やし、単一または隣接する構造27間で記録を可能にする。しかし、このようなアレイは、テトロデスに比べて電極部位の位置決めにおいて柔軟性が低い。さらに、高密度プローブでは、tetrodes28、29、30によって取得されたデータをミラーリングするために、隣接チャネルのアクションポテンシャルに関する情報を抽出するために、複雑なスパイクソートアルゴリズムが必要です。したがって、単一ユニットの全体的な収率は、多くの場合、テトロデスよりも低いです。さらに、シリコンプローブは、その脆弱性と高コストのために不利です。したがって、テトロデス対シリコンプローブの選択は、記録の目的に依存し、記録部位で高い単一単位または空間プロファイリングの高い収率を得るかどうかが優先されるかどうかが問題である。
神経活動を記録することに加えて、光遺伝学的操作は、特定の細胞の種類や経路が神経回路機能にどのように寄与するかを調べる神経科学のより強力なツールの一つとなっています13,31, 32、33.しかし、光遺伝学的実験は、光源34、35、36に光ファイバコネクタを取り付けるためにマイクロドライブアレイ設計に追加の考慮を必要とする。多くの場合、光ファイバを接続するには比較的大きな力が必要であり、脳内のプローブの機械的シフトにつながる可能性があります。したがって、従来のマイクロドライブアレイに埋め込み型光ファイバを組み合わせるのは簡単な作業ではありません。
上記の理由から、研究者は、電極の種類の選択を最適化するか、記録の目的に応じて光ファイバを埋め込む必要がある。例えばテトロデスは海馬1、13においてより高い単位収率を達成するために使用され、シリコンプローブは中間内皮質(MEC)37などの皮質領域の層深度プロファイルを調製するために使用される。現在、テトロデスとシリコンプローブの同時移植のためのマイクロドライブは、ラット5,11について報告されていた。しかし、マイクロドライブの重量、マウスヘッド上のスペースの限り、異なるプローブを採用するようにマイクロドライブを設計するための空間要件のために、マウスに複数のテトロデスとシリコンプローブを埋め込むことは非常に困難です。マイクロドライブなしでシリコンプローブを埋め込むことは可能であるが、この手順はプローブの調整を可能にせず、シリコンプローブ回収12、38の成功率を低下させる。さらに、光遺伝学的実験は、マイクロドライブアレイ設計に追加の考慮事項を必要とします。このプロトコルは、自由に動くマウスで慢性記録用のマイクロドライブアレイを構築して移植する方法を示し、9つの独立して調節可能なテトロデスと1つの調節可能な光シリコンプローブの移植を可能にする。このマイクロドライブの配列はまたシリコン調査の光遺伝学的実験そして回復を促進する。
このプロトコルは、独立した調節可能な四位体と自由に振る舞うマウスのシリコンプローブを使用して、2つの脳領域からの神経活動の記録を可能にするハイブリッドマイクロドライブアレイを構築し、移植する方法を示す。また、光遺伝学的実験と実験後のシリコンプローブの回収を示す。調整可能なシリコンプローブ33またはオプトシリコンプローブ36?…
The authors have nothing to disclose.
本研究は、日本学術振興会海外研究フェローシップ協会(HO)、奨学金プログラム(TK)、ヒューマンフロンティアサイエンスプログラム(TK)、脳研究財団(TK)、教員科学技術取得、および一部の支援を受けています。リテンションプログラム(TK)、脳行動研究財団(TK)、住友財団研究助成金(JY)、NARSAD若手研究者研究助成金(JY)。私たちは、原稿の準備中に貴重なコメントや提案のためにW.マークスに感謝します。
#00-90 screw | J.I. Morris | #00-90-1/8 | EIB screws |
#0-80 nut | Small Parts | B00DGB7CT2 | brass nut for holding fiber ferrule holder |
#0-80 screw | Small Parts | B000FMZ57G | brass machine screw for probe connector mount, fiber ferrule holder, and shielding cone |
22 Ga polyetheretherketone tubes | Small Parts | SLPT-22-24 | for attaching to the shuttle, 0.025 inches inner diameter |
23 Ga stainless tubing | Small Parts | HTX-23R | for tetrode |
23 Ga stainless wire | Small Parts | HTX-23R-24-10 | for L-shape/support wire |
26 Ga stainless wire | Small Parts | GWX-0200 | for guide-posts |
30 Ga stainless wire | Small Parts | HTX-30R | for tetrode |
3-D CAD software package | Dassault Systèmes | SolidWorks 2003 | |
3D printer | FormLab | Form2 | |
5.5mil polyimide insulating tubes | HPC Medical | 72113900001-012 | |
aluminum foil tape | Tyco | Tyco Adhesives 617022 Aluminum Foil Tape | for the alternative shielding cone |
conductive paste | YSHIELD | HSF54 | for shielding cone |
customized screws for silicon-probe microdrive | AMT | UNM1.25-HalfMoon | half-moon stainless screw, 1.5 mm diameter, 300 µm thread pitch |
customized screws for tetrode microdrive | AMT | Yamamoto_0000-160_9mm | slotted stainless screw, 0.5 mm diameter, 160 µm thread pitch, custom-made to order for our design |
dental acrylic | Stoelting | 51459 | |
dental model resin | FormLab | RS-F2-DMBE-02 | |
Dremel rotary tool | Dremel | model 800 | a grinder |
drill bit | Fine Science Tool | 19007-05 | |
electric interface board | Neuralynx | EIB-36-Narrow | |
epoxy | Devcon | GLU-735.90 | 5 minutes epoxy |
eye ointment | Dechra | Puralube Ophthalmic Ointment | to prevent mice eyes from drying during surgery |
fiber polishing sheet | Thorlabs | LFG5P | for polishing the optical fiber |
fine tweezers | Protech International | 15-368 | for loading/recovering the silicon probe |
gold pins | Neuralynx | EIB Pins Small | |
ground wire | A-M Systems | 781500 | 0.010 inch bare silver wire |
headstage preamp | Neuralynx | HS-36 | |
impedance meter | BAK electronics | Model IMP-2 | 1 kHz testing frequency |
mineral oil | ZONA | 36-105 | for lubricating screws and wires |
optical fiber | Doric | MFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT | |
Recording system | Neuralynx | Digital Lynx 4SX | |
ruby fiber scribe | Thorlabs | S90R | for cleaving the optical fiber |
silicon grease | Fine Science Tool | 29051-45 | |
silicon probe | Neuronexus | A1x32-Edge-5mm-20-177 | Fig. 3, 4A, 4B, 5 |
silicon probe | Neuronexus | A1x32-6mm-50-177 | Fig. 4C |
silicon probe washing solution | Alcon | AL10078844 | contact lens cleaner |
silicone lubber | Smooth-On | Dragon Skin 10 FAST | for preparation of microdrive mold |
silver paint | GC electronic | 22-023 | silver print II coating, used for ground wires |
skull screw | Otto Frei | 2647-10AC | 0.8 mm diameter, 0.200 mm thread pitch |
standard surgical scissors | ROBOZ | RS-5880 | |
stereotaxic apparatus | Kopf | Model 942 | |
super glue | Loctite | LOC230992 | for applying to guide-posts |
surgical tweezers | ROBOZ | RS-5135 | |
Tetrode Twister | Jun Yamamoto | TT-01 | |
tetrode wires | Sandvik | PX000004 |