يصف هذا البروتوكول بناء صفيف محرك صغير هجين يسمح بزرع تسعة تيترودقابل قابل للتعديل بشكل مستقل ومسبار واحد قابل للتعديل للأوبتو-السيليكون في منطقتين من مناطق الدماغ في الفئران المتحركة بحرية. كما تبين طريقة لاسترداد بأمان وإعادة استخدام مسبار السيليكون الأوبتو لأغراض متعددة.
يمكن أن توفر التسجيلات العصبية متعددة المناطق معلومات حاسمة لفهم التفاعلات على نطاق زمني دقيق بين مناطق الدماغ المتعددة. ومع ذلك، فإن تصاميم المحركات الصغيرة التقليدية غالباً ما تسمح فقط باستخدام نوع واحد من الأقطاب الكهربائية للتسجيل من مناطق مفردة أو متعددة، مما يحد من العائد من تسجيلات ملف تعريف وحدة واحدة أو عمق. كما أنه غالباً ما يحد من القدرة على الجمع بين تسجيلات القطب الكهربائي مع الأدوات الوراثية البصرية لاستهداف المسار و / أو نوع الخلية نشاط معين. يعرض هنا مجموعة محرك أقراص صغيرة هجينة للفئران المتحركة بحرية لتحسين العائد ووصف ًا لتلفيقها وإعادة استخدامها لصفيف microdrive. يستخدم التصميم الحالي تسعة tetrodes ومسبار واحد من السيليكون الأوبتو المزروعة في منطقتين الدماغ المختلفة في وقت واحد في الفئران تتحرك بحرية. وtetrodes ومسبار opto-silicon قابلة للتعديل بشكل مستقل على طول محور الظهر في الدماغ لتحقيق أقصى قدر من العائد من وحدة والأنشطة المذبذبة. كما تتضمن صفيفة المحركات الدقيقة هذه مجموعة للمعالجة البصرية الخفيفة والوسيطة للتحقيق في الاستجابات والوظائف الإقليمية أو الخاصة بالخلايا من الدوائر العصبية البعيدة المدى. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استعادة مسبار السيليكون الأوبتو بأمان وإعادة استخدامه بعد كل تجربة. نظرًا لأن صفيف microdrive يتكون من أجزاء مطبوعة ثلاثية الأبعاد، يمكن تعديل تصميم محركات الأقراص الصغيرة بسهولة لاستيعاب إعدادات مختلفة. وصف لأول مرة هو تصميم مجموعة microdrive وكيفية إرفاق الألياف البصرية إلى مسبار السيليكون لتجارب علم الوراثة البصرية، تليها تصنيع حزمة tetrode وزرع مجموعة في الدماغ الماوس. كما أن تسجيل الإمكانات الميدانية المحلية والتجسس على الوحدة إلى جانب التحفيز البصري الوراثي يدل أيضاً على جدوى نظام صفيف اتّساع الأقراص الدقيقة في الفئران المتحركة بحرية.
من المهم أن نفهم كيف يدعم النشاط العصبي العملية المعرفية، مثل التعلم والذاكرة، من خلال التحقيق في كيفية تفاعل مناطق الدماغ المختلفة بشكل حيوي مع بعضها البعض. لتوضيح ديناميات النشاط العصبي الكامنة وراء المهام المعرفية، وقد أجريت على نطاق واسع الفيزيولوجيا الكهربائية خارج الخلية في الحيوانات تتحرك بحرية مع المعونة من صفائف microdrive1،2،3، 4. في العقدين الماضيين، تم تطوير عدة أنواع من مجموعة microdrive لزرع الأقطاب الكهربائية في مناطق الدماغ متعددة للفئران5،6،7،8 والفئران9، 10 سنوات , 11 , 12.ومع ذلك، تصاميم microdrive الحالية عموما لا تسمح لاستخدام أنواع متعددة من التحقيق، مما اضطر الباحثين لاختيار نوع قطب واحد مع فوائد محددة والقيود. على سبيل المثال، صفائف tetrode تعمل بشكل جيد لمناطق الدماغ ذات الكثافة السكانية العالية مثل الحصين السدورية CA11،13، في حين أن تحقيقات السيليكون تعطي لمحة هندسية أفضل لدراسة الاتصالات التشريحية14 , 15.
وغالبا ما تستخدم Tetrodes وتحقيقات السيليكون لتسجيل في الجسم الحي المزمن، ولكل منها مزاياها وعيوبها الخاصة. وقد ثبت Tetrodes لديها مزايا كبيرة في عزل وحدة واحدة أفضل من أقطاب واحدة16،17، بالإضافة إلى فعالية التكلفة والصلابة الميكانيكية. كما أنها توفر عوائد أعلى من أنشطةوحدة واحدة عندما جنبا إلى جنب مع محركات الأقراص الصغيرة 8،18،19،20. من الضروري زيادة عدد الخلايا العصبية المسجلة في وقت واحد لفهم وظيفة الدوائر العصبية21. على سبيل المثال، هناك حاجة إلى أعداد كبيرة من الخلايا للتحقيق في مجموعات صغيرة من أنواع الخلايا غير المتجانسة وظيفيا مثل 22 ذات الصلة بالوقت أو مكافأة الترميز23 خلية. مطلوب أرقام خلايا أعلى بكثير لتحسين جودة فك التشفير من تسلسل ارتفاع13،24،25.
Tetrodes، ومع ذلك، لديها عيب في تسجيل الخلايا الموزعة مكانيا، كما هو الحال في القشرة أو المهاد. وعلى النقيض من التيترودي، يمكن أن توفر تحقيقات السيليكون التوزيع المكاني والتفاعل بين الإمكانات الميدانية المحلية (LFPs) وأنشطة التنصت داخل الهيكل المحلي14و26. تحقيقات السيليكون متعددة الساق زيادة عدد مواقع التسجيل والسماح بالتسجيل عبر هياكل واحدة أو مجاورة27. ومع ذلك، فإن هذه الصفائف أقل مرونة في تحديد مواقع الأقطاب الكهربائية مقارنة بـ tetrodes. وبالإضافة إلى ذلك، مطلوب خوارزميات فرز ارتفاع معقدة في تحقيقات عالية الكثافة لاستخراج المعلومات حول إمكانات العمل من القنوات المجاورة لعكس البيانات التي تم الحصول عليها من قبل tetrodes28،29،30. وبالتالي، فإن العائد الإجمالي للوحدات الفردية غالبا ما يكون أقل من التيترودي. وعلاوة على ذلك، فإن تحقيقات السيليكون غير مواتية بسبب هشاشتها وارتفاع تكلفتها. وبالتالي، فإن اختيار التيتروديس مقابل تحقيقات السيليكون يعتمد على الهدف من التسجيل، وهو ما إذا كان الحصول على عائد عال من الوحدات الواحدة أو التنميط المكاني في مواقع التسجيل هو الأولوية.
بالإضافة إلى تسجيل النشاط العصبي، أصبح التلاعب الجيني البصري واحدة من الأدوات الأكثر قوة في علم الأعصاب لدراسة كيفية مساهمة أنواع الخلايا المحددة و / أو مسارات وظائف الدائرة العصبية13،31، 32و33. ومع ذلك، تتطلب التجارب البصرية الاعتبار الإضافي في تصميم صفيف microdrive لإرفاق موصل الألياف لتحفيز مصادر الضوء34،35،36. في كثير من الأحيان، ربط الألياف البصرية يتطلب قوة كبيرة نسبيا، والتي قد تؤدي إلى تحول ميكانيكي من التحقيق في الدماغ. ولذلك، فإنه ليس مهمة تافهة للجمع بين الألياف البصرية القابلة للزرع إلى صفائف microdrive التقليدية.
للأسباب المذكورة أعلاه، يطلب من الباحثين لتحسين اختيار نوع القطب الكهربائي أو لزرع الألياف البصرية اعتمادا على الهدف من التسجيل. على سبيل المثال يتم استخدام tetrodes لتحقيق أعلى العائد وحدة في الحصين1،13، في حين يتم استخدام تحقيقات السيليكون للتحقيق في ملف عمق اللامينار من المناطق القشرية ، مثل القشرة الانطوفية الوسيطة (MEC)37. وفي الوقت الراهن، تم الإبلاغ عن محركات الأقراص الدقيقة لزرع التيتروديس وتحقيقات السيليكون في وقت واحد للفئران5و11. ومع ذلك، فإنه من الصعب للغاية لزرع tetrodes متعددة وتحقيقات السيليكون في الفئران بسبب وزن microdrives، مساحة محدودة على رأس الماوس، والمتطلبات المكانية لتصميم microdrive لتوظيف تحقيقات مختلفة. على الرغم من أنه من الممكن زرع تحقيقات السيليكون دون microdrive، وهذا الإجراء لا يسمح لتعديل التحقيق ويقلل من معدل نجاح استرداد السيليكون التحقيق12،38. وعلاوة على ذلك، تتطلب التجارب البصريات اعتبارات إضافية في تصميم صفيف اتّساح. يوضح هذا البروتوكول كيفية بناء وغرس صفيف microdrive للتسجيل المزمن في الفئران المتحركة بحرية، والذي يسمح بزرع تسعة tetrodes قابل للتعديل بشكل مستقل وواحد قابل للتعديل البصريات السيليكون التحقيق. كما تسهل هذه المجموعة الميكرودرايف التجارب البصرية واسترداد مسبار السيليكون.
يوضح البروتوكول كيفية بناء وغرس صفيف محرك صغير هجين يسمح بتسجيل الأنشطة العصبية من منطقتين من الدماغ باستخدام tetrodes قابل للتعديل مستقلة ومسبار السيليكون في الفئران تتصرف بحرية. كما أنه يوضح التجارب البصرية واستعادة مسبار السيليكون بعد التجارب. في حين أن قابل للتعديل السيليكون التحقيق<sup c…
The authors have nothing to disclose.
وقد دعم هذا العمل جزئيا من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم في الخارج الزمالات البحثية (HO)، وهبت برنامج العلماء (TK)، وبرنامج علوم الحدود البشرية (TK)، ومؤسسة أبحاث الدماغ (TK)، كلية العلوم والتكنولوجيا اكتساب واكتساب برنامج الاحتفاظ (TK)، ومؤسسة أبحاث الدماغ والسلوك (TK)، ومنحة أبحاث مؤسسة سوميتومو (JY)، منحة أبحاث الباحث الشاب NARSAD (JY). نشكر و. ماركس على التعليقات والاقتراحات القيمة أثناء إعداد المخطوطة.
#00-90 screw | J.I. Morris | #00-90-1/8 | EIB screws |
#0-80 nut | Small Parts | B00DGB7CT2 | brass nut for holding fiber ferrule holder |
#0-80 screw | Small Parts | B000FMZ57G | brass machine screw for probe connector mount, fiber ferrule holder, and shielding cone |
22 Ga polyetheretherketone tubes | Small Parts | SLPT-22-24 | for attaching to the shuttle, 0.025 inches inner diameter |
23 Ga stainless tubing | Small Parts | HTX-23R | for tetrode |
23 Ga stainless wire | Small Parts | HTX-23R-24-10 | for L-shape/support wire |
26 Ga stainless wire | Small Parts | GWX-0200 | for guide-posts |
30 Ga stainless wire | Small Parts | HTX-30R | for tetrode |
3-D CAD software package | Dassault Systèmes | SolidWorks 2003 | |
3D printer | FormLab | Form2 | |
5.5mil polyimide insulating tubes | HPC Medical | 72113900001-012 | |
aluminum foil tape | Tyco | Tyco Adhesives 617022 Aluminum Foil Tape | for the alternative shielding cone |
conductive paste | YSHIELD | HSF54 | for shielding cone |
customized screws for silicon-probe microdrive | AMT | UNM1.25-HalfMoon | half-moon stainless screw, 1.5 mm diameter, 300 µm thread pitch |
customized screws for tetrode microdrive | AMT | Yamamoto_0000-160_9mm | slotted stainless screw, 0.5 mm diameter, 160 µm thread pitch, custom-made to order for our design |
dental acrylic | Stoelting | 51459 | |
dental model resin | FormLab | RS-F2-DMBE-02 | |
Dremel rotary tool | Dremel | model 800 | a grinder |
drill bit | Fine Science Tool | 19007-05 | |
electric interface board | Neuralynx | EIB-36-Narrow | |
epoxy | Devcon | GLU-735.90 | 5 minutes epoxy |
eye ointment | Dechra | Puralube Ophthalmic Ointment | to prevent mice eyes from drying during surgery |
fiber polishing sheet | Thorlabs | LFG5P | for polishing the optical fiber |
fine tweezers | Protech International | 15-368 | for loading/recovering the silicon probe |
gold pins | Neuralynx | EIB Pins Small | |
ground wire | A-M Systems | 781500 | 0.010 inch bare silver wire |
headstage preamp | Neuralynx | HS-36 | |
impedance meter | BAK electronics | Model IMP-2 | 1 kHz testing frequency |
mineral oil | ZONA | 36-105 | for lubricating screws and wires |
optical fiber | Doric | MFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT | |
Recording system | Neuralynx | Digital Lynx 4SX | |
ruby fiber scribe | Thorlabs | S90R | for cleaving the optical fiber |
silicon grease | Fine Science Tool | 29051-45 | |
silicon probe | Neuronexus | A1x32-Edge-5mm-20-177 | Fig. 3, 4A, 4B, 5 |
silicon probe | Neuronexus | A1x32-6mm-50-177 | Fig. 4C |
silicon probe washing solution | Alcon | AL10078844 | contact lens cleaner |
silicone lubber | Smooth-On | Dragon Skin 10 FAST | for preparation of microdrive mold |
silver paint | GC electronic | 22-023 | silver print II coating, used for ground wires |
skull screw | Otto Frei | 2647-10AC | 0.8 mm diameter, 0.200 mm thread pitch |
standard surgical scissors | ROBOZ | RS-5880 | |
stereotaxic apparatus | Kopf | Model 942 | |
super glue | Loctite | LOC230992 | for applying to guide-posts |
surgical tweezers | ROBOZ | RS-5135 | |
Tetrode Twister | Jun Yamamoto | TT-01 | |
tetrode wires | Sandvik | PX000004 |