Genredigeringsteknologier har gjort det muligt for forskere at generere zebrafiskmutanter til at undersøge genfunktionen med relativ lethed. Her giver vi en guide til at udføre parallelle embryo genotyping og kvantificering af in situ hybridisering signaler i zebrafisk. Denne upartiske tilgang giver større nøjagtighed i fænotypiske analyser baseret på in situ hybridisering.
In situ hybridization (ISH) er en vigtig teknik, der gør det muligt for forskere at studere mRNA distribution in situ og har været en kritisk teknik i udviklingsmæssige biologi i årtier. Traditionelt, de fleste genekspression undersøgelser baseret på visuel evaluering af ISH signal, en metode, der er tilbøjelig til bias, især i tilfælde, hvor prøven identiteter er kendt på forhånd. Vi har tidligere rapporteret om en metode til at omgå denne bias og give en mere præcis kvantificering af ISH signaler. Her præsenterer vi en enkel vejledning til at anvende denne metode til at kvantificere ekspressionsniveauerne af gener af interesse for ISH-farvede embryoner og korrelere det med deres tilsvarende genotyper. Metoden er især nyttig til at kvantificere geografisk begrænsede genekspressionssignaler i prøver af blandede genotyper, og den giver et upartisk og nøjagtigt alternativ til de traditionelle visuelle scoringsmetoder.
Indførelsen af genomredigeringsteknologier (ZFN, TALENs og senest CRISPR/Cas9) har ført til en massiv stigning i antallet af laboratorier rundt om i verden, der gør brug af disse systemer til at studere funktionen af specifikke gener in vivo. Især zebrafisk er modtagelige for genetisk manipulation , og mange mutanter er blevet genereret i de seneste1,2. For udviklingsmæssige biologer, en af de mest almindelige metoder til at vurdere de fænotypiske konsekvenser af genmutationer i embryonale udvikling er in situ hybridisering (ISH). I mangel af åbenlyse morfologiske defekter, der adskiller homozygote mutanter fra deres vilde type eller heterozygote søskende, er det vigtigt at kunne identificere forskellige genotyper korrekt.
Klassisk ISH bygger på kvalitative analyser af signalintensiteter for at drage konklusioner om lovgivningsmæssige interaktioner mellem genet af interesse og udvalgte markørgener. Selvom det er nyttigt, lider disse analyser af tekniske variationer og kan være forudindtaget af forskerens forventninger. Der blev således udviklet en metode til kvantificering af genekspression efter billeddannelse af ISH-farvede embryoner uden forudgående kendskab til den tilsvarende genotype. Dette blev efterfulgt af en effektiv DNA-ekstraktion og genoyping, der tillod os at kvantætt korrelere genotype med genekspression3. Mens genosoping af embryoner post ISH er blevet brugt før4,5, billedbaseret kvantificering af ISH mønstre har ikke været almindeligt anvendt bortset fra et par undersøgelser6,7. De mest populære alternativer er afhængige af visuel scoring eller optælling af ISH-farvede celler8,9,10, både tilbøjelige til dårlig reproducerbarhed og forsker bias. Denne metode er især nyttig til at undersøge ændringer i gener med udtryksmønstre, der er geografisk begrænsede, såsom runx1 eller gata2b, begge udtrykt i en begrænset delmængde af aortiske gulvceller kaldet hæmogeninentel11,12.
Her sigter vi mod at give en praktisk vejledning til gennemførelsen af kvantificeringen ved billedanalyse ved hjælp af Fiji13samt DNA-ekstraktions- og genoypingprotokollen. Dette er beregnet til visuelt at illustrere vores tidligere offentliggjorte metode3. Vores metode giver mulighed for en nøjagtig repræsentation af variationen i genekspression opdaget af ISH og en upartisk tildeling af genekspressionsniveauer til specifikke genotyper.
Der bør tages et par faktorer i betragtning, når du bruger denne metode til at kvantificere genekspressionen. Billeddannelsesforholdene skal opretholdes under hele forsøget (f.eks. belysning, eksponeringstider og embryonpositionering) for at reducere variabiliteten mellem målingerne. Et kritisk punkt er at undgå overfarvning af prøverne, da forskelle i farvning mellem prøver kan maskeres. F.eks. kunne faldet i VegfA-udtrykket i mangel af Eto2 i Xenopus laevis-embryoner 30 kun påvises ved nøje at overvåge farvning over en 24 timers periode. Det er således god praksis empirisk at bestemme passende farvningsniveauer for hvert gen, der bedst repræsenterer dets udtryk, uden at nå mætning. Overstaining vil også kunstigt øge baggrundspixelintensiteten i de konverterede 8-bit gråtonebilleder og skævvride kvantificeringsresultaterne. I ekstreme tilfælde kan baggrundsniveauet i embryonale væv være højere end ISH-signalet i det valgte investeringsafkast, og disse prøver bør udelukkes fra analysen. Et lignende fænomen blev observeret, da vi testede egnetheden af den ufarvede æggeblomme til baggrundskorrektion (figur 4). Efter inversion og konvertering til 8-bit bliver de mørkere pixels i blommeregionen lysere end ISH-signalet i fosteret og gør baggrundskorrigerede værdier negative. Undgå således at bruge blommen til baggrundskorrektion. Måling af baggrundssignalet i pigmenterede områder i embryonet (f.eks. øjnene eller rygdelen af stammen fra 26/28 hpf og fremefter) vil ligeledes skævvride kvantificeringsresultaterne og bør også undgås. Der er protokoller til rådighed for blegning zebrafisk embryoner, enten før eller efter ISH18 og blegning embryoner ældre end 24 hpf før billeddannelse anbefales.
Da denne metode er afhængig af at måle pixelintensiteten i et defineret område mod en baggrundspixelintensitet i et tilsvarende ikke-plettet område, er det ikke hensigtsmæssigt at kvantificere allestedsnærværende eller næsten allestedsnærværende udtrykte gener, som det er. I stedet er den velegnet til måling af gener med en geografisk begrænset fordeling, hvor et område til måling af baggrundspixelintensitet let kan identificeres. Vores yderligere analyse tyder nu på, at brug af et mindre område (3-4x mindre) for baggrundskorrektion giver lignende resultater til at bruge et tilsvarende areal som for investeringsafkastet. Dette udvider anvendeligheden af metoden til gener udtrykt i bredere rumlige domæner (og kræver dermed større roi’er til intensitetsmålinger), så længe man kan anvende klart ubejdsede områder af fosteret til baggrundskorrektion.
Endelig foreslår vi, at genoyping udføres parallelt eller efter billedet skvantificering for at minimere eksperimentator bias. Beder en anden eksperimentator at gentage kvantitationen på anonymiserede prøver og sammenligne med det første sæt målinger vil også bidrage til at reducere eksperimentatorbias. Hvis de billeder, der skal kvantificeres, er fra en sammenligning mellem behandlinger, der ikke kræver genoyping (f.eks. vildtype vs. kemisk hæmmer eller vildtype vs. MO-knockdown), skal den eksperimentator, der udfører målingerne, blændes til identiteten af Prøve.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke personalet i Biomedical Services i Oxford og Birmingham for fremragende zebrafiskopdræt. TD blev finansieret af en Wellcome Trust Kromosom og Udviklingsmæssige Biologi ph.d.-stipendium (#WT102345/Z/13/Z). R.M. og M.K. blev finansieret af British Heart Foundation (BHF IBSR Fellowship FS/13/50/30436) og er taknemmelige for deres generøse støtte. R.M. anerkender støtte fra BHF Centre of Research Excellence (RE/13/1/30181), Oxford.
0.2 mL PCR tubes (8-strips with lids) | StarLab | A1402-3700 | 96-well plates are equally appropriate for sample handling but beware of cross contamination between samples |
3 mL Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4114 | |
Cavity slides | Brand | BR475535-50EA | |
Digital Camera (Qimaging Micropublisher 5.0) | Qimaging | ||
Eppendorf Microloader tips | Eppendorf | 10289651 | the tips are used to orient the embryos for imaging in glycerol |
Excel | Microsoft | ||
F3000 Fiber Optic Cold Light Source | Photonic | ||
Fiji | |||
Glycerol | Sigma | G5516-1L | |
Graphpad Prism 8.01 | GraphPad Software, Inc. | we prefer to use Graphpad, but other statistics software packages are also suitable (e.g. SigmaPlot or SPSS) | |
HotSHOT alkaline lysis buffer | 25 mM NaOH, 0.2 mM disodium EDTA, pH 12 | ||
HotSHOT neutralization buffer | Tris HCl 40 mM, pH 5 | ||
PBS (10X) pH 7.4 | Thermofisher | 70011044 | |
Stereomicroscope with illumination stand (Nikon SMZ800N) | Nikon | ||
Thermocycler | Thermofisher |