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Biologia do Desenvolvimento

Genotipado y cuantificación de la tinción de hibridación in situ en el pez cebra

Published: January 28, 2020
doi:
10.3791/59956
, ,
1MRC Molecular Haematology Unit, MRC Weatherall Institute of Molecular Medicine, John Radcliffe Hospital,University of Oxford, 2BHF Centre of Research Excellence, 3Institute of Cancer and Genomic Sciences,University of Birmingham

Summary

Las tecnologías de edición de genes han permitido a los investigadores generar mutantes de peces cebra para investigar la función génica con relativa facilidad. Aquí, proporcionamos una guía para realizar el genotipado de embriones paralelos y la cuantificación de señales de hibridación in situ en peces cebra. Este enfoque imparcial proporciona una mayor precisión en los análisis fenotípicos basados en la hibridación in situ.

Abstract

La hibridación in situ (ISH) es una técnica importante que permite a los investigadores estudiar la distribución de ARNm in situ y ha sido una técnica crítica en biología del desarrollo durante décadas. Tradicionalmente, la mayoría de los estudios de expresión génica se basaban en la evaluación visual de la señal DE ISH, un método que es propenso al sesgo, particularmente en los casos en que las identidades de la muestra se conocen a priori. Hemos informado previamente sobre un método para eludir este sesgo y proporcionar una cuantificación más precisa de las señales ISH. Aquí, presentamos una guía sencilla para aplicar este método para cuantificar los niveles de expresión de genes de interés en embriones teñidos de ISH y correlacionar eso con sus genotipos correspondientes. El método es particularmente útil para cuantificar las señales de expresión génica restringidas espacialmente en muestras de genotipos mixtos y proporciona una alternativa imparcial y precisa a los métodos tradicionales de puntuación visual.

Introduction

La introducción de tecnologías de edición del genoma (ZFN, TALENs y más recientemente, CRISPR/Cas9) ha llevado a un aumento masivo en el número de laboratorios de todo el mundo que hacen uso de estos sistemas para estudiar la función de genes específicos in vivo. Los peces cebra en particular son susceptibles de manipulación genética y muchos mutantes se han generado en el pasadoreciente 1,2. Para los biólogos del desarrollo, uno de los métodos más comunes para evaluar las consecuencias fenotípicas de las mutaciones genéticas en el desarrollo embrionario es la hibridación in situ (ISH). En ausencia de defectos morfológicos obvios que separan a los mutantes homocigotos de su tipo salvaje o hermanos heterocigotos, es esencial poder identificar correctamente diferentes genotipos con precisión.

La ISH clásica se basa en análisis cualitativos de intensidades de señal para obtener conclusiones sobre las interacciones regulatorias entre el gen de interés y los genes marcadores seleccionados. Aunque son útiles, estos análisis sufren de variación técnica y pueden estar sesgados por las expectativas de los investigadores. Así, se desarrolló un método para cuantificar la expresión génica después de tomar imágenes de embriones teñidos de ISH, sin conocimiento previo del genotipo correspondiente. Esto fue seguido por una extracción y genotipado eficiente de ADN que nos permitió correlacionar cuantitativamente el genotipo con la expresión génica3. Mientras que el genotipado de embriones post ISH se ha utilizado antes de4,5, cuantificación basada en imágenes de patrones de ISH no ha sido ampliamente utilizado aparte de un par de estudios6,7. Las alternativas más populares se basan en la puntuación visual o el recuento de células manchadas de ISH8,9,10, ambas propensas a la mala reproducibilidad y el sesgo del investigador. Este método es particularmente útil para estudiar los cambios en los genes con patrones de expresión que están restringidos espacialmente, como runx1 o gata2b,ambos expresados en un subconjunto restringido de células de suelo aórticas llamado endotelio hemogénico11,12.

Aquí, pretendemos proporcionar una guía práctica para la implementación de la cuantificación mediante el análisis de imágenes utilizando Fiji13,así como el protocolo de extracción y genotipado de ADN. Esto está destinado a ilustrar visualmente nuestro método publicado anteriormente3. Nuestro método permite una representación precisa de la variación en la expresión génica detectada por la ISH y una asignación imparcial de los niveles de expresión génica a genotipos específicos.

Protocol

Los procedimientos que involucran sujetos animales están regulados por la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) de 1986 y han sido aprobados por el Home Office y el Organismo local de Bienestar Etico y Bienestar Animal. 1. Embriones teñidos con eEI de imagen Preparar una solución de glicerol (50%–80% en 1x tampón PBS) y mezclar para homogeneizar la solución (por ejemplo, dejar en un rodillo durante al menos 5 min). Esta solución se puede mantener durante meses a temperatura ambiente. Después de la hibridación in situ14,15,16,17, transferir embriones a la solución de glicerol con una pipeta Pasteur de 3 ml y dejar de conformarse durante al menos 5 min. Si los embriones por imágenes mayores de 24 hpf (horas posteriores a la fertilización), pueden blanquearse como se describe18. Preparar y etiquetar suficientes tubos de PCR para transferir embriones manchados de ISH después de la toma de imágenes. Añadir 100% glicerol a la parte inferior del pozo en un tobogán de depresión de vidrio con una pipeta Pasteur de 3 ml. Con una pipeta Pasteur de 3 ml, transfiera un solo embrión teñido de ISH a la diapositiva de vidrio y oriente según sea necesario bajo un estereomicroscopio equipado con una cámara digital e iluminación inferior y superior.NOTA: Utilice puntas de pipeta de carga de gel para colocar los embriones para la toma de imágenes, pero otras herramientas (por ejemplo, fórceps, aguja de disección) serán igualmente adecuadas. Con el primer embrión, ajuste el tiempo de iluminación y exposición en el aumento deseado. Utilice estas condiciones para TODOS los embriones en el mismo experimento (es decir, si la imagen de 40 embriones de un mutante heterocigoto se cruza, asegúrese de que la iluminación, el tiempo de exposición y el aumento sean los mismos para todos). Imagen de tantos embriones como sea necesario. Etiquete cada imagen con un número único. Después de la toma de imágenes, transfiera el embrión a un tubo/placa de PCR etiquetado con el mismo número.NOTA: Las imágenes deben guardarse como archivos TIF, pero otros formatos también son adecuados. Si es necesario, retire el exceso de glicerol en los tubos/placas de PCR.NOTA: En este punto, los embriones se pueden almacenar en los tubos de PCR durante varias semanas a temperatura ambiente. 2. Extraer EL ADN y el genotipo de los embriones teñidos de ISH NOTA: Aquí, utilice un método fiable y económico para aislar el ADN genómico basado en el método HoTSHOT19 con una eficiencia de extracción de ADN de 95%-100%3. Una vez completada la toma de imágenes, añada 40-75 ml de tampón de lisis alcalina (p. ej., HoTSHOT) a cada tubo. Incubar a 95 oC durante aproximadamente 30 minutos y enfriar los tubos a 4 oC antes de añadir un volumen igual de tampón de neutralización. Una incubación durante la noche a 4 oC puede mejorar la eficiencia de la PCR.NOTA: En este punto, el ADN genómico se puede utilizar para el genotipado o almacenarse a -20 oC hasta que sea necesario. Muestras de genotipo con un método adecuado (por ejemplo, HRMA, RFLP)3,20,21 según sea necesario para la mutación de interés. Tenga en cuenta el genotipo correspondiente a cada muestra (por ejemplo, utilizando un software de hoja de cálculo). 3. Cuantificar la intensidad de píxeles de los embriones teñidos con ISH (análisis de imágenes utilizando el software Fiji) Para cuantificar la intensidad de la señal de tinción de hibridación in situ (ISH), convierta todas las imágenes a escala de grises de 8 bits como se describe3. Si las imágenes se guardaron como . TIF, utilice una macro de Fiji para la conversión por lotes3. También puede convertir imágenes en otros formatos (por ejemplo, . JPG) a . TIF utilizando el software adecuado y luego convertir a escala de grises de 8 bits utilizando Fiji. Para mayor comodidad, aquí está el procedimiento paso a paso que se publicó anteriormente3, con algunas alteraciones. Abra imágenes en Fiji e invierta la imagen con Edición > Invertir. A continuación, cambie el tipo de imagen a 8 bits(Imagen > Texto > 8 bits). Con la herramienta de selección de polígonos, dibuje la región de interés (ROI) manualmente en la imagen alrededor de la región que contiene la señal. Pulse t para abrir el gestor de ROI. Utilice el comando Measure del gestor de ROI para medir la intensidad del ROI. Copie el valor medio de la ventana Resultados a un software de hoja de cálculo. Mueva el mismo ROI, asegurando el mismo tamaño y forma que la región original, a una región del pez cebra que no contenga ninguna tinción. Repita el paso 3.4 para medir el fondo. Para obtener la intensidad media de píxeles de la señal ISH, reste el valor medio de intensidad de la región de fondo del de la región manchada para cada embrión. Asigne cada valor de intensidad a un genotipo (del paso 2.3). 4. Analizar los resultados con pruebas estadísticas apropiadas Trazar todos los valores en una gráfica Q-Q para identificar cualquier desviación de la distribución normal.NOTA: La distribución normal también se puede verificar con la prueba Kolmogorov-Smirnov o la prueba Shapiro-Wilk. Sin embargo, para los tamaños de muestra grandes existe un alto riesgo de falsos positivos en estas pruebas. Si hay fuertes desviaciones de la distribución normal, transforme todos los valores (mediante las funciones ln o sqrt) para asegurarse de que normalmente se distribuyen antes de continuar. Analice las diferencias entre los valores (transformados si es necesario) asignados a cada genotipo (wt vs. heterocigoto frente a mutante) con ANOVA de 2 colas con niveles de confianza del 95%, teniendo en cuenta la igualdad de varianzas con una prueba de Levene y corrección Welch. Para comparaciones por pares entre cada par de genotipos, utilice la prueba posthoc de Tukey (varianzas iguales) o Games-Howell (varianzas desiguales). Si los valores no se distribuyen normalmente a pesar de la transformación, utilice una prueba no paramétrica (Kruskall-Wallis) para analizar las diferencias entre los valores clasificados y la prueba de comparaciones múltiples de Dunn post-hoc con la corrección de Bonferroni para la corrección por pares Comparaciones. Trazar los valores no transformados (del paso 3.6) como trazados de puntos para obtener la mejor representación de los resultados.

Representative Results

Aquí, describimos la aplicación práctica de la tubería para la cuantificación de imágenes y el genotipado de embriones tal como se publicó en otros lugares3. El flujo de trabajo del método se muestra en la Figura 1. Para ilustrar cómo utilizar este método, ish se realizó para dnmt3bb.1 en embriones de 33 hpf de un runx1W84X/+22 incross(Figura 2). Se crearon 130 embriones utilizando las mismas condiciones de iluminación que se detallan en el protocolo y los etiquetaron con un número único. Después de la toma de imágenes, cada embrión fue transferido a un tubo de PCR para el genotipado. En este punto, el análisis de imagen se realizó para atribuir un valor de intensidad de píxel a cada imagen. El genotipo se asignó entonces a su imagen correspondiente y los valores de intensidad de píxeles agrupados según su genotipo para el análisis estadístico. Se detectó una disminución en la expresión dnmt3bb.1 en mutantes runx1W84X/W84X (Figura 2A,B)3, de acuerdo con observaciones anteriores5. Curiosamente, los embriones heterocigotos runx1W84X/+ no mostraron diferencias significativas en la expresión dnmt3bb.1 (Figura 2A,B)en comparación con sus hermanos de tipo salvaje, lo que sugiere que una copia de Runx1 es suficiente para mantener la expresión dnmt3bb.1 en los niveles adecuados. Muchos mutantes de peces cebra no muestran un fenotipo embrionario que de otro modo se puede detectar utilizando otras tecnologías de pérdida de función como los oligonucleótidos morfomorfos (MO). Esta discrepancia puede atribuirse a una serie de causas como los efectos fuera del objetivo, la compensación de proteínas maternas, un alelos hipomórfico23 o el fenómeno recientemente descubierto de compensación genética24,25,26,27. En este ejemplo, preguntamos si la expresión runx1 se redujo o se perdió en lmo4auob100 mutantes ya que los datos publicados anteriormente con un MO de lmo4a sugirieron que runx1 se reduce en los morfos lmo4a 28. Aquí, el análisis no reveló diferencias significativas en la expresión de runx1 entre el tipo salvaje y lmo4auob100 mutantes homocigotos3 (Figura 3A,B). Un análisis adicional por un solo embrión qPCR mostró que había una pequeña pero significativa disminución en la expresión de runx1 en lmo4auob100 mutantes(Figura 3C). Por lo tanto, es posible que la cuantificación de imágenes no pueda detectar pequeñas diferencias en los niveles de expresión. Alternativamente, la falta de diferencia entre los genotipos que detectamos es real y los experimentos qPCR están detectando cambios en la expresión de runx1 en otros tejidos como el telenchephalon donde se expresan lmo4a y runx1. Los investigadores siempre deben verificar sus resultados con un método independiente como qPCR, pero idealmente enriquecedor para el tejido de interés por citometría de flujo, por ejemplo. En raras ocasiones, cuando la ISH tiene un fondo alto(Figura 3D),el valor de intensidad de píxeles de esta área es tan alto que la resta del valor de la señal produce un número negativo y, en tales casos, esos embriones serían excluidos del análisis. En nuestra experiencia, esto ocurrió en aproximadamente el 0,4% de los embriones sondeados con runx13, pero puede variar entre experimentos, sondas o lotes de reactivos. Aunque eso podría ser una limitación del método, es muy poco probable que la baja frecuencia de fondo alto influya en los resultados generales. Para probar el efecto de seleccionar diferentes áreas para correcciones de fondo, primero medimos la intensidad de píxeles de la señal IS de runx1 en embriones de 28 hpf, utilizando diferentes regiones para correcciones de fondo(Figura 4). Se seleccionaron cuatro regiones diferentes: dos en la región troncal (R1 y R2), una en la región de la yema (sin manchas, pero que probablemente acumulen tinción de fondo) y un área más pequeña anterior al ROI (R4, Figura 4B). La medición de la intensidad de los píxeles en estas regiones mostró una diferencia de intensidad relativamente estable entre el ROI y cualquier área de fondo(Figura 4C). Sin embargo, R3 siempre mostró valores muy altos (por encima de los del ROI). Después de la inversión y conversión a 8 bits, la región de la yema parece muy brillante y por lo tanto no es adecuado para su uso como corrección de fondo. R2 estaba más cerca del ROI, pero contenía alguna señal ISH, y usarlo para la corrección disminuyó la intensidad media del píxel en comparación con R1 (situado más dorsalmente, lejos de la señal ISH) o R4. Por lo tanto, R1 o R4 son áreas apropiadas que se pueden utilizar para la corrección de fondo (a pesar de que el área de R4 es menor que la de R1). A continuación, queríamos comparar cómo el uso de R1 o R4 afectaba a los resultados al comparar la expresión runx1. Para ello, hemos cruzado dll4+/- heterozygotes29 y analizamos la expresión runx1 en embriones de tipo salvaje seleccionados aleatoriamente y dll4-/-(Figura 4E). Aunque el uso de R1 o R4 para la corrección de fondo afectaba a valores individuales, las intensidades medias de píxeles dentro del mismo genotipo no eran significativamente diferentes(Figura 4E). Por otra parte, la comparación de la expresión runx1 todavía produce valores de intensidad media similares entre los genotipos utilizando áreas R1 o R4 como corrección de fondo (-R1-16.3 yR4-18.2,respectivamente). En conjunto, llegamos a la conclusión de que aunque la elección del área de fondo es importante, el criterio principal es que no incluye las regiones de yema (propensas a la acumulación de tinción de fondo) y que no debe contener ninguna tinción (específica) que pueda sesgar los valores de intensidad de píxeles del fondo. Figura 1: Flujo de trabajo del protocolo paralelo de cuantificación y genotipado de imágenes. Los embriones recogidos de un cruce de peces heterocigotos para un alelo mutante son sondeados para el gen medido con un protocolo ISH estándar. Después de la toma de imágenes, el ADN genómico se extrae utilizando el protocolo HotSHOT añadiendo el tampón de lisis directamente al embrión en un tubo de PCR de 0,2 ml, seguido de una incubación de 30 minutos a 95 oC. Este ADN se utiliza para el genotipado de embriones por PCR, PCR y polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP), ensayos KASP o cualquier otro método apropiado. Paralelamente, las imágenes de cada embrión se invierten y se convierten a escala de grises de 8 bits. Los ROI de forma y tamaño idénticos que contienen la señal ISH (amarillo) y el fondo (azul) se seleccionan y miden manualmente. Las mediciones, asignadas a los genotipos correspondientes, se analizan estadísticamente. Figura adaptada de Dobrzycki et al.3Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: La cuantificación de imágenes en mutantes runx1 revela niveles reducidos de expresión dnmt3bb.1 por ISH. (A) Ejemplo de imágenes de ISH en 33 hpf tipo salvaje (azul), runx1+/W84X (verde) y runx1W84X/W84X (naranja) embriones, mostrando la expresión dnmt3bb.1 en la aorta dorsal. (B) Los valores de intensidad de píxeles de dnmt3bb.1 mRNA en embriones runx1W84X/W84X(n-36) se reducen significativamente en comparación con los tipos silvestres (n-32) y los heterocigotos (n-62) (ANOVA, p < 0,001). Los coeficientes de variación son 24%, 22% y 21% para los grupos de tipo salvaje, heterocigoto y mutante, respectivamente. El punto de datos azul, verde y naranja corresponde a las imágenes de ejemplo del panel A. Las barras representan la media de la letra s.d. ***p<0.001 (prueba post-hoc de Games-Howell). Figura adaptada de Dobrzycki et al.3Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Medición de los niveles de expresión de runx1 por ISH en lmo4auob100mutantes. (A) Imágenes representativas de ISH para runx1 en 28 hpf tipo salvaje (azul), heterocigoto (verde) y lmo4auob100/uob100 (naranja) embriones, mostrando la expresión en la aorta dorsal. (B) Cuantificación de la señal mRNA runx1, detectado por ISH, de 28 hpf de tipo salvaje (n-15), lmo4aheterocigoto+/- (het) (n-34) y lmo4auob100/uob100 embrión mutante (n-18) de un embrague no muestra ninguna diferencia significativa en la intensidad de píxeles runx1 entre los diferentes genotipos (ANOVA,> p 0.6). El punto de datos azul, verde y naranja corresponde a las imágenes de ejemplo del panel A. Las barras representan la media de los embriones de la mitad de la letra s.d. (C) que muestran los niveles normalizados de arnm de runx1 (2- Ct) en un solo tipo salvaje (azul; n-12) y lmo4auob100/uob100 (mut, naranja; n-12), medidos por qRT-PCR, mostrando niveles reducidos de runx1 en los mutantes en comparación con el tipo salvaje. *p < 0.05 (pruebat). (D) Ejemplo de un experimento de ISH en un embrión de 28 hpf (teñido para runx1, puntas de flecha amarillas) que muestra fondo alto. Figura adaptada de Dobrzycki et al.3Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Efecto de la corrección de la intensidad de fondo en los resultados de la medición. (A) Imagen representativa de la tinción isla de runx1 en un embrión de tipo salvaje a 28 hpf. (B) La misma imagen después de la inversión y la conversión a 8 bits. La región de interés (ROI) se resalta en verde y cuatro áreas diferentes utilizadas para la corrección de fondo (R1-R4) se resaltan en amarillo. (C) Mediciones de intensidad de píxeles sin procesar en todas las regiones mostradas en el panel B. Tenga en cuenta que la intensidad en R3 (yema) es consistentemente mayor que la señal ISH real en el ROI (n-11). (D) niveles de expresión Runx1 en el ROI mediante áreas de fondo R1, R2 y R4. Zonas para ROI, R1, R2 y R3-28500 píxeles; R4 a 8500 píxeles. Tenga en cuenta que el fondo R3 no se utilizó para esta comparación, ya que la corrección de fondo (ROI-R3) produjo consistentemente valores negativos. (E) Niveles de expresión Runx1 en tipo salvaje y dll4-/- mutantes utilizando R1 o R4 para la corrección en segundo plano (n-10 para cada muestra). El análisis estadístico en los paneles D y E se realizó utilizando una prueba kruskal-Wallis no paramétrica, suponiendo que los valores de intensidad de píxeles no se distribuyen normalmente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Se deben tener en cuenta algunos factores al utilizar este método para cuantificar la expresión génica. Las condiciones de imagen deben mantenerse durante todo el experimento (por ejemplo, iluminación, tiempos de exposición y posicionamiento embrionario) para reducir la variabilidad entre las mediciones. Un punto crítico es evitar el exceso de manchas de las muestras, ya que las diferencias en la tinción entre las muestras pueden enmascararse. Por ejemplo, la disminución de la expresión de VegfA en ausencia de Eto2 en embriones de Xenopus laevis 30 sólo podría detectarse monitoreando cuidadosamente las manchas durante un período de 24 horas. Por lo tanto, es una buena práctica determinar empíricamente los niveles de tinción adecuados para cada gen que mejor representen su expresión, sin alcanzar la saturación. El sobre-tining también aumentará artificialmente la intensidad del píxel de fondo en las imágenes en escala de grises de 8 bits convertidas y sesgará los resultados de la cuantificación. En casos extremos, el nivel de fondo en los tejidos embrionarios podría ser mayor que la señal ISH en el ROI seleccionado y estas muestras deben excluirse del análisis. Un fenómeno similar se observó cuando probamos la idoneidad de la yema no manchada para la corrección de fondo(Figura 4). Después de la inversión y conversión a 8 bits, los píxeles más oscuros en la región de la yema se vuelven más brillantes que la señal ISH en el embrión y hacen que los valores corregidos de fondo sean negativos. Por lo tanto, evitar el uso de la yema para la corrección de fondo. La medición de la señal de fondo en áreas pigmentadas del embrión (por ejemplo, los ojos o la parte dorsal del tronco a partir de 26/28 hpf) sesgará igualmente los resultados de la cuantificación y también debe evitarse. Existen protocolos disponibles para blanquear embriones de pez cebra, antes o después de ISH18 y embriones de blanqueo mayores de 24 hpf antes de que se recomiende la toma de imágenes.

Debido a que este método se basa en medir la intensidad del píxel en un área definida contra una intensidad de píxel de fondo en un área no manchada equivalente, no es apropiado para la cuantificación de genes ubicuos o casi ubicuamente expresados tal como está. En su lugar, es adecuado para medir la expresión de genes con una distribución restringida espacialmente donde un área para medir la intensidad de los píxeles de fondo se puede identificar fácilmente. Nuestro análisis adicional sugiere ahora que el uso de un área más pequeña (3-4x más pequeña) para la corrección de fondo produce resultados similares al uso de un área equivalente a la del ROI. Esto extiende la aplicabilidad del método a genes expresados en dominios espaciales más amplios (y, por lo tanto, requieren ROI más grandes para las mediciones de intensidad), siempre y cuando se puedan utilizar áreas claramente no manchadas del embrión para la corrección de fondo.

Por último, sugerimos que el genotipado se realice en paralelo o después de la cuantificación de la imagen para minimizar el sesgo del experimentador. Pedir a un segundo experimentador que repita la cuantificación en muestras anónimas y se compare con el primer conjunto de mediciones también ayudará a reducir el sesgo del experimentador. Si las imágenes a cuantificar proceden de una comparación entre tratamientos que no requieren genotipado (por ejemplo, tipo salvaje vs inhibidor químico o tipo salvaje frente al derribo MO), el experimentador que realice las mediciones debe cegarse a la identidad del Muestra.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer al personal de los Servicios Biomédicos en Oxford y Birmingham por su excelente cría de peces cebra. T.D. fue financiado por una Beca de Doctorado en Cromo y Biología del Desarrollo de Wellcome Trust (#WT102345/Z/13/Z). R.M. y M.K. fueron financiados por la British Heart Foundation (BHF IBSR Fellowship FS/13/50/30436) y están agradecidos por su generoso apoyo. R.M. reconoce el apoyo del Centro de Excelencia en Investigación de BHF (RE/13/1/30181), Oxford.

Materials

0.2 mL PCR tubes (8-strips with lids) StarLab A1402-3700 96-well plates are equally appropriate for sample handling but beware of cross contamination between samples
3 mL Pasteur pipettes Alpha Laboratories LW4114
Cavity slides Brand BR475535-50EA
Digital Camera (Qimaging Micropublisher 5.0) Qimaging
Eppendorf Microloader tips Eppendorf 10289651 the tips are used to orient the embryos for imaging in glycerol
Excel Microsoft
F3000 Fiber Optic Cold Light Source Photonic
Fiji
Glycerol Sigma G5516-1L
Graphpad Prism 8.01 GraphPad Software, Inc. we prefer to use Graphpad, but other statistics software packages are also suitable (e.g. SigmaPlot or SPSS)
HotSHOT alkaline lysis buffer 25 mM NaOH, 0.2 mM disodium EDTA, pH 12
HotSHOT neutralization buffer Tris HCl 40 mM, pH 5
PBS (10X) pH 7.4 Thermofisher 70011044
Stereomicroscope with illumination stand (Nikon SMZ800N) Nikon
Thermocycler Thermofisher
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Referências

  1. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  2. Varshney, G. K., et al. CRISPRz: a database of zebrafish validated sgRNAs. Nucleic Acids Research. 44 (D1), D822-D826 (2016).
  3. Dobrzycki, T., Krecsmarik, M., Bonkhofer, F., Patient, R., Monteiro, R. An optimised pipeline for parallel image-based quantification of gene expression and genotyping after in situ hybridisation. Biology Open. 7 (4), bio031096 (2018).
  4. Bresciani, E., et al. CBFbeta and RUNX1 are required at 2 different steps during the development of hematopoietic stem cells in zebrafish. Blood. 124 (1), 70-78 (2014).
  5. Gore, A. V., et al. Epigenetic regulation of hematopoiesis by DNA methylation. Elife. 5, e11813 (2016).
  6. Fan, Y., et al. Tissue-Specific Gain of RTK Signalling Uncovers Selective Cell Vulnerability during Embryogenesis. PLoS Genetics. 11 (9), e1005533 (2015).
  7. Wen, B., et al. GATA5 SUMOylation is indispensable for zebrafish cardiac development. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (7), 1691-1701 (2017).
  8. Espin-Palazon, R., et al. Proinflammatory signaling regulates hematopoietic stem cell emergence. Cell. 159 (5), 1070-1085 (2014).
  9. Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Biologia do Desenvolvimento. 311 (2), 623-635 (2007).
  10. Genthe, J. R., Clements, W. K. R-spondin 1 is required for specification of hematopoietic stem cells through Wnt16 and Vegfa signaling pathways. Development. 144 (4), 590-600 (2017).
  11. Kalev-Zylinska, M. L., et al. Runx1 is required for zebrafish blood and vessel development and expression of a human RUNX1-CBF2T1 transgene advances a model for studies of leukemogenesis. Development. 129 (8), 2015-2030 (2002).
  12. Butko, E., et al. Gata2b is a restricted early regulator of hemogenic endothelium in the zebrafish embryo. Development. 142 (6), 1050-1061 (2015).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Lleras Forero, L., et al. Segmentation of the zebrafish axial skeleton relies on notochord sheath cells and not on the segmentation clock. Elife. 7, (2018).
  15. Jowett, T., Yan, Y. L. Double fluorescent in situ hybridization to zebrafish embryos. Trends in Genetics. 12 (10), 387-389 (1996).
  16. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
  17. Narayanan, R., Oates, A. C. Detection of mRNA by Whole Mount in situ Hybridization and DNA Extraction for Genotyping of Zebrafish Embryos. Bio-protocol. , e3193 (2019).
  18. Monteiro, R., Pouget, C., Patient, R. The gata1/pu.1 lineage fate paradigm varies between blood populations and is modulated by tif1gamma. EMBO JOURNAL. 30 (6), 1093-1103 (2011).
  19. Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
  20. Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
  21. Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
  22. Jin, H., et al. Definitive hematopoietic stem/progenitor cells manifest distinct differentiation output in the zebrafish VDA and PBI. Developement. 136 (4), 647-654 (2009).
  23. Stainier, D. Y. R., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), e1007000 (2017).
  24. El-Brolosy, M. A., Stainier, D. Y. R. Genetic compensation: A phenomenon in search of mechanisms. PLoS Genetics. 13 (7), e1006780 (2017).
  25. Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
  26. Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).
  27. El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).
  28. Meier, N., et al. Novel binding partners of Ldb1 are required for haematopoietic development. Development. 133 (24), 4913-4923 (2006).
  29. Kettleborough, R. N., et al. A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function. Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).
  30. Leung, A., et al. Uncoupling VEGFA functions in arteriogenesis and hematopoietic stem cell specification. Developmental Cell. 24 (2), 144-158 (2013).

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Dobrzycki, T., Krecsmarik, M., Monteiro, R. Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish. J. Vis. Exp. (155), e59956, doi:10.3791/59956 (2020).
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