제브라피시의 인시투 혼성화 염색의 게놈 및 정량화
Summary
유전자 편집 기술은 연구원이 상대적으로 쉽게 유전자 기능을 조사하기 위해 제브라피시 돌연변이를 생성할 수 있게 했습니다. 여기서, 우리는 제브라피시에서 의 회동 배아 하노티핑 및 정량화 신호를 수행하는 가이드를 제공한다. 이러한 편견없는 접근 방식은 situ 하이브리드화를 기반으로 한 현상별 분석에서 더 높은 정확도를 제공합니다.
Abstract
situ 혼성화에서 (ISH)는 연구원이 그(것)에 있는 mRNA 분포를 공부하는 것을 가능하게 하는 중요한 기술이고 수십 년 동안 발달 생물학에 있는 중요한 기술이었습니다. 전통적으로, 대부분의 유전자 발현 연구는 특히 샘플 정체성이 선험적이라고 알려진 경우에, 편견에 수그린 방법인 ISH 신호의 시각적 평가에 의존했습니다. 우리는 이전에 이러한 편견을 우회하고 ISH 신호의 보다 정확한 정량화를 제공하는 방법에 대해 보고했습니다. 여기에서, 우리는 ISH 염색한 태아에 있는 관심 있는 유전자의 발현 수준을 정량화하고 그들의 대응하는 유전자형과 상관관계를 지정하기 위하여 이 방법을 적용하는 간단한 가이드를 제시합니다. 이 방법은 혼합 된 유전자형의 샘플에서 공간적으로 제한된 유전자 발현 신호를 정량화하는 데 특히 유용하며 전통적인 시각적 채점 방법에 대한 편견없고 정확한 대안을 제공합니다.
Introduction
게놈 편집 기술 (ZFN, TALEN 및 최근에는 CRISPR /Cas9)의 도입은 생체 내에서 특정 유전자의 기능을 연구하기 위해 이러한 시스템을 사용하는 전 세계 실험실의 수가 크게 증가했습니다. 특히 제브라피쉬는 유전적 조작이 가능하며 최근1,2에서많은 돌연변이가 발생하고 있다. 발달 생물학자를 위해, 배아 발달에 있는 유전자 돌연변이의 현상상 결과를 평가하는 일반적인 방법의 한개는 situ 혼성화에 있습니다 (ISH). 그들의 야생 모형 또는 이형 형제에서 동형 접합 돌연변이를 분리하는 명백한 형태학적 결함이 없는 경우에, 정확하게 다른 유전형을 정확하게 확인할 수 있는 것이 필수적입니다.
고전 ISH는 관심있는 유전자와 선택된 마커 유전자 사이의 규제 상호 작용에 대한 결론을 도출하기 위해 신호 강도의 질적 분석에 의존합니다. 유용하지만 이러한 분석은 기술적 변화로 인해 어려움을 겪고 있으며 연구자 기대치에 의해 편향될 수 있습니다. 따라서, 상응하는 유전자형에 대한 사전 지식 없이, 이식된 ISH 염색 배아를 이미징한 후 유전자 발현을 정량화하는 방법이 개발되었다. 이것은 우리가 유전자 발현3과유전자형을 정량적으로 상관시키는 것을 허용하는 능률적인 DNA 추출 및 유전자 형질분석이 뒤따랐습니다. 4, 5, 이미지 기반 의 정량화는연구6,7을제외하고는 널리 사용되지 않은,4,5,이전에 사용되어 온 배아포스트ISH의 지질형 화. 가장 인기있는 대안은 시각적 인 채점 또는 ISH 염색 세포의 계산에 의존8,9,10,모두 가난한 재현성과 연구자 편견에 경향이있다. 이 방법은 특히 runx1 또는 gata2b와같이 공간적으로 제한되는 발현 패턴을 가진 유전자의 변화를 연구하는데 유용하며, 둘 다 혈생 내피(11,12)라고불리는 대동맥 바닥 세포의 제한된 서브세트에서 발현된다.
여기서, 우리는 피지13을이용한 영상 분석에 의한 정량화의 구현에 대한 실용적인 가이드뿐만 아니라 DNA 추출 및 지질질성 분석 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 한다. 이는 이전에 게시된 메서드3을시각적으로 설명하기 위한 것입니다. 우리의 방법은 특정 유전자형에 대한 ISH 및 유전자 발현 수준의 편견 없는 할당에 의해 검출된 유전자 발현의 변이의 정확한 표현을 허용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
유전자 발현을 정량화하기 위하여 이 방법을 사용할 때 몇몇 요인이 고려되어야 합니다. 이미징 조건은 측정 사이의 가변성을 줄이기 위해 실험 전반에 걸쳐 유지되어야 합니다(예: 조명, 노출 시간 및 배아 위치 지정). 중요한 점은 샘플 간의 염색 의 차이가 가려질 수 있기 때문에 샘플의 과중 얼룩을 피하는 것입니다. 예를 들어, 제노푸스 라에비스 배아(30)에서 Eto2가 없는 경우 VegfA 발현의 감소는 24시간 동안 염색을 주의 깊게 모니터링하여검출될 수 있었다. 따라서, 경험적으로 포화에 도달하지 않고, 그것의 발현을 가장 잘 나타내는 각 유전자에 대한 적절한 염색 수준을 결정하는 것이 좋습니다. 또한 오버스테인은 변환된 8비트 그레이스케일 이미지의 배경 픽셀 강도를 인위적으로 증가시키고 정량 결과를 왜곡합니다. 극단적인 경우에, 배아 조직에 있는 배경 수준은 선택된 ROI에 있는 ISH 신호 보다는 높을 지도 모르다 및 이 견본은 분석에서 제외되어야 합니다. 배경 보정을 위해 얼룩지지 않은 노른자의 적합성을 테스트했을 때 유사한 현상이 관찰되었습니다(도4). 반전 및 8비트로 변환된 후 노른자 영역의 어두운 픽셀은 배아의 ISH 신호보다 밝아지고 배경 보정 값을 음수로 렌더링합니다. 따라서, 배경 보정을 위해 노른자의 사용을 피한다. 배아의 색소 부위(예: 26/28 hpf 이후의 트렁크의 눈 또는 등쪽 부분)에서 배경 신호를 측정하면 정량 결과를 똑같이 왜곡하고 피해야 합니다. 제브라피쉬 배아 표백에 사용할 수 있는 프로토콜이 있는데, 이는 이미징이 권장되기 전에 ISH18 및 24 hpf 이상의 표백 배아를 표백하기 전이나 후에 가능합니다.
이 방법은 동등한 비염색 영역에서 배경 픽셀 강도에 대해 정의된 영역에서 픽셀 강도를 측정하는 데 의존하기 때문에 유비쿼터스 또는 유비쿼터스 발현 된 유전자의 양량화에는 적절하지 않습니다. 대신, 배경 픽셀 강도를 측정하기 위한 영역을 쉽게 식별할 수 있는 공간적으로 제한된 분포를 가진 유전자의 발현을 측정하는 데 적합합니다. 우리의 추가 분석은 이제 배경 보정을 위해 더 작은 영역 (3-4 배 더 작음)을 사용하면 ROI와 동등한 영역을 사용하는 것과 유사한 결과를 얻을 수 있음을 시사합니다. 이것은 배경 보정을 위해 배아의 명확한 얼룩이 없는 영역을 사용할 수 있는 한 더 넓은 공간 도메인에서 발현되는 유전자(따라서 강도 측정을 위해 더 큰 ROI를 요구함)로 이 방법의 적용 가능성을 확장합니다.
마지막으로, 실험자 편향을 최소화하기 위해 이미지 정량화 후 또는 실험자 비측을 병렬로 수행하거나 이를 수행하는 것이 좋습니다. 두 번째 실험자가 익명화된 샘플의 정량을 반복하고 첫 번째 측정 세트와 비교하도록 요청하면 실험자의 편향을 줄이는 데도 도움이 됩니다. 정량화할 이미지가 유전형 질이 필요하지 않은 치료법 간의 비교(예: 야생형 대 화학억제제 또는 야생형 대 MO 녹다운)의 비교에서 나온 경우, 측정을 수행하는 실험자는 샘플.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 우수한 얼룩말 물고기 축산에 대한 옥스포드와 버밍엄에서 생물 의학 서비스의 직원에게 감사드립니다. T.D.는 웰컴 트러스트 염색체 및 발달 생물학 박사 장학금 (#WT102345/Z/13/Z)에 의해 지원되었습니다. R.M.과 M.K.는 영국 심장 재단(BHF IBSR 펠로우십 FS/13/50/30436)의 후원을 받았으며, 그들의 후한 지원에 감사드립니다. R.M.은 BHF 연구 우수 센터 (RE / 13/1/30181), 옥스포드의 지원을 인정합니다.
Materials
| 0.2 mL PCR tubes (8-strips with lids) | StarLab | A1402-3700 | 96-well plates are equally appropriate for sample handling but beware of cross contamination between samples |
| 3 mL Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4114 | |
| Cavity slides | Brand | BR475535-50EA | |
| Digital Camera (Qimaging Micropublisher 5.0) | Qimaging | ||
| Eppendorf Microloader tips | Eppendorf | 10289651 | the tips are used to orient the embryos for imaging in glycerol |
| Excel | Microsoft | ||
| F3000 Fiber Optic Cold Light Source | Photonic | ||
| Fiji | |||
| Glycerol | Sigma | G5516-1L | |
| Graphpad Prism 8.01 | GraphPad Software, Inc. | we prefer to use Graphpad, but other statistics software packages are also suitable (e.g. SigmaPlot or SPSS) | |
| HotSHOT alkaline lysis buffer | 25 mM NaOH, 0.2 mM disodium EDTA, pH 12 | ||
| HotSHOT neutralization buffer | Tris HCl 40 mM, pH 5 | ||
| PBS (10X) pH 7.4 | Thermofisher | 70011044 | |
| Stereomicroscope with illumination stand (Nikon SMZ800N) | Nikon | ||
| Thermocycler | Thermofisher |
Referências
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