Summary

In vitro Generation fare kalp alanı-spesifik kardiyak progenitor hücreler

Published: July 03, 2019
doi:

Summary

Bu yöntemin amacı, progenitör hücre spesifikasyonu ve fonksiyonel özelliklerini incelemek ve kalp hastalığı modelleme için oda spesifik kardiyak hücreler oluşturmak için, in vitro kalp alanına özgü kardiyak progenitör hücreleri oluşturmadır.

Abstract

Pluripotent kök hücreleri kalp gelişimi ve hastalık ve rejeneratif tıp anlamak için büyük bir potansiyel sunuyor. Gelişimsel kardiyolojideki son gelişmeler, pluripotent kök hücrelerinden kardiyak hücreler üretmeye yol açtı, Eğer iki kardiyak alan-ilk ve ikinci kalp alanları (FHF ve SHF) — pluripotent kök hücreler sistemlerinde indüklenir. Bunu ele almak için, In vitro spesifikasyon ve kalp alanına özgü kardiyak progenitör hücrelerinin izolasyonu için bir protokol oluşturacağız. Hcn4-GFP ve Tbx1-CRE taşıyan embriyonik kök hücre hatları kullandık; FHF ve SHF ‘nin Rosa-RFP gazetecileri, sırasıyla ve hücre membranı protein Cxcr4, bir SHF Marker canlı hücre immün boyama. Bu yaklaşım ile, biz fonksiyonel özellikleri ve onların in vivo karşı transkriptom özetlemek progenitör hücreler oluşturuldu. Protokollerimiz, iki kalp alanlarının erken spesifikasyonları ve ayrım çalışması için ve kalp hastalığı modelleme için odasına özgü kardiyak hücreler oluşturmak için kullanılabilir. Bu bir in vitro nevuslardır sistemi olduğundan, hassas anatomik bilgiler sağlayamayabilir. Ancak, bu sistem gastrülasyon-aşama embriyoları kötü erişilebilirlik üstesinden gelir ve yüksek verim ekranlar için ölçeklendirilebilir.

Introduction

Pluripotent kök hücrelerinin kullanımı (PSC ‘ler) kardiyak rejenerasyon ve kişisel tıp alanında hastalık modelleme ve ilaç terapileri için hasta spesifik miyositlerle devrim yarattı1,2,3, 4. daha yakın zamanda, atriyal vs ventriküler üretimi için in vitro protokoller ve pacemaker gibi PSC türevi kardiyomiyositler geliştirilmiştir5,6. Bununla birlikte, kardiyogenezinin kardiyak gelişimi incelemek ve daha sonra ventriküler odasına özgü kardiyak hücreler oluşturmak için yeniden oluşturulabilir olup olmadığı hala belirsiz.

Erken embriyonik gelişim sırasında, BMP4 gibi salgılanmış morfojenlerin etkisi altında Mezodermal hücreler, Wnts ve Activin A form ilkel çizgi7. Mesp1 ifadesi ile işaretlenmiş kardiyak Mezodermal hücreler, kalp hilal ve sonra ilkel kalp tüpü7,8oluşturmak için anteriora ve latterly göç. Bu göç grubu hücre kalp progenitör hücrelerin iki çok farklı nüfus içerir (TBM), yani ilk ve ikinci kalp alanı (FHF ve SHF)9,10. SHF hücreleri yüksek proliferatif ve göç ve öncelikle uzama ve kalp tüpü döngü sorumludur. Ayrıca, SHF hücreleri kardiyomiyositler ayırt, fibroblastlar, düz kas ve endotel hücreler onlar sağ ventrikül oluşturmak için kalp tüpü girerken, sağ ventriküler çıkış yolu ve hem Atria büyük parçası7,10. Buna karşılık, FHF hücreleri daha az proliferatif ve göç ve onlar sol ventrikül ve Atria11daha küçük bir kısmı yükselmesine gibi kardiyomiyositler çoğunlukla ayırt. Ayrıca, SHF ataları Tbx1, FGF8, FGF10 ve Six2 ifadesiyle işaretlenmiş iken FHF hücreleri Express Hcn4 ve Tbx511, 12,13,14,15.

PSC ‘ler üç germ katmanını ve daha sonra vücudun4,16‘ daki herhangi bir hücre tipine ayırt edebilir. Bu nedenle, kalp gelişimini anlamak ve konjenital kalp hastalığı ile sonuçlanan spesifik gelişimsel kusurları modelleme için muazzam bir potansiyel sunuyoruz, Doğum kusurlarının en sık nedeni17. Konjenital kalp hastalığının büyük bir alt grubu, Odaya özgü kardiyak anormallikleri içerir18,19. Ancak, hala bu anormalli kalp alanı gelişimi kaynaklanan olup olmadığını belirsiz. Buna ek olarak, kardiyomiyositlerin doğumdan sonra proliferasyon yetersizlik göz önüne alındığında, kalp rejenerasyonu için kardiyak doku oluşturmak için geniş çaba olmuştur1,7,20. Kardiyak Odalar arasındaki fizyolojik ve morfolojik farklılıkları göz önünde bulundurarak, PSC ‘leri kullanarak odaya özgü kalp dokusu üretme önemli bir öneme sahiptir. Gelişimsel kardiyolojideki son gelişmeler, PSC ‘lerde iki kalp alanlarının indüklenmiş olması durumunda, hala belirsizdir.

İn vitro kardiyogenezi ve TBM ‘lerin spesifikasyonunu ve özelliklerini incelemek için, daha önce PSC ‘den türeyen kardiyak küre21,22,23,24farklılaşmasına dayanan bir sistem kullandık. Son zamanlarda, FHF geni Hcn4 ve SHF geni Tbx1 kontrolü altında GFP ve RFP muhabirleri ile fare embriyonik kök hücreleri (mESCs) ürettik (mESCsTbx1-CRE; Rosa-RFP; HCN4-GFP) 25. In vitro farklılaşmış mescs, Gfp + ve RFP + hücrelerinin iki farklı mezodermal hücre alanlarından ortaya çıktığı ve tamamlayıcı bir şekilde desenli kardiyak kürler oluşturdu. Elde edilen GFP + ve RFP + hücreleri, sırasıyla RNA sıralaması ve klonal analizler ile belirlenen FHF ve SHF özelliklerini sergiledi. Önemlisi, Isl1-RFP muhabiri (mESCIsl1-RFP) taşıyan mescs kullanarak, BIZ SHF hücrelerinin sadakatle hücre yüzeyı protein CXCR4 tarafından işaretlenmiş olduğunu keşfetti ve bu transgenes olmadan kalp alanına özgü hücrelerin yalıtım etkinleştirebilirsiniz. Mevcut protokol, odağa özel kalp hastalığının incelenmesi için değerli bir araç olarak hizmet veren mESCs ‘den kalp alanına özgü TBM ‘lerin oluşumunu ve yalıtımını tarif edecektir.

Protocol

Not: In vitro nesil kalp alanına özgü fare kardiyak progenitör hücreler (Şekil 1). 1. fare ESCs Bakımı MESCs büyümeye (mESCsTbx1-CRE; Rosa-RFP; HCN4-Gfp, mescIsl1-RFP)25 üzerinde 0,1% (w/v) jelatin kaplı T25 flsorlar 2i Orta (870 ml toplarlar asgari temel Orta (gmem), 100 ml fetal sığır serumu (FBS), 10 ml glutamax, 10 ml olmayan esansiyel amino asitler, 10 ml…

Representative Results

Yaklaşık 132 farklılaşma sonrasında Tbx1-RFP ve Hcn4-GFP TBM ‘Ler floresan mikroskop kullanılarak tespit edilebilir (Şekil 2). Genellikle, GFP ve RFP hücreleri yaklaşık olarak aynı anda görünür. TBM ‘lerin iki nüfusu yakın ve yaygın olarak tamamlayıcı bir desen genişletmek için devam ediyor. Activin A ve BMP4 konsantrasyonlarını ayarlamak FHF vs SHF TBM ‘lerin yüzdeleri değiştirir (Şekil 3). TBM belirtimi içinde vitro öncelikle BMP4 …

Discussion

Protokolimizde, kalp kürleri ve izole kalp alanına özgü TBM ‘Ler oluşturmak için bir metodoloji tarif ediyoruz. Bunlar, TBM spesifikasyonlarının mekanizmaları ve özelliklerinin yanı sıra kardiyak odasına özel hastalık modelleme için de kullanılabilir. Daha önce yayınlanmış bir çalışma, iki floresan muhabiriyle (Mef2c/nkx 2.5) bir mESC hattı kullanmış ve kardiyogenezi in vitro olarak incelemek için, her iki işaretçinin de kardiyomiyositler zaten26meydana geldiğinde em…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

E. T. Magic this Matters ve AHA tarafından desteklenmektedir. C. K. NICHD/NıH (R01HD086026), AHA ve MSCRF tarafından hibe tarafından destekleniyordu.

Materials

β-mercaptoethanol Sigma M6250
0.1% (w/v) Gelatin EMD Millipore ES-006-B
100mM Sodium Pyruvate Gibco 11360
100X Pen/Strep Gibco 15070-063
1X PBS w/o Calcium and Magnesium Thermo Fisher Scientific 21-040-CV
20% Paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific 50-980-493
5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer BD Falcon 35223
Activin A R & D Systems 338-AC-010
Ascorbic Acid Sigma A-4544
B27 minus vitamin A (50x) Thermo Fisher Scientific 12587010
BMP4 R & D Systems 314-BP
Bovine Serum Albumin Sigma A2153
Cell sorter Sony SH800 Sony or any other fluorescence-activated cell sorter
Cell strainer 70μm Thermo Fisher Scientific 08-771-2
Centrifuge Sorvall Legend XT Thermo Fisher Scientific 75004508
CHIR99021 Selleck chemicals S2924
CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific 51030285
Corning Ultra Low Attachment T75 flask Corning 07-200-875
Countless II FL automated cell counter Thermo Fisher Scientific
Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate Thermo Fisher Scientific A-31571, Lot #1757130
Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM) Gibco 11965-092
EDTA Sigma E6758
ESGRO (LIF) Millipore ESG1106
EVOS FL microscope Thermo Fisher Scientific AMF4300
Fetal Bovine Serum Invitrogen SH30071.03
Glasgow’s MEM (GMEM) Gibco 11710035
GlutaMAX (100 x) Gibco 35050-061
Ham’s F12 Gibco 10-080-CV
HEPES Sigma H3375
IMDM Gibco 12440053
Monothioglycero (MTG) Sigma M-6145
Mouse anti-Troponin T antibody Thermo Fisher Scientific MS-295-P1
N2-SUPPLEMENT Gibco 17502-048
Non-essential amino acid solution (NEAA Invitrogen 11140-050
PD0325901 Selleckchem S1036
PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody Thermo Fisher Scientific 46-9991-82
Suspension culture dish 150 mm x 25mm Corning 430597
T25 flasks Corning 353109
TrypLE (Trypsin) Gibco 12604
Y-27632 (ROCK inhibitor) Stem cell technologies 72304

Referências

  1. Laflamme, M. A., Murray, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
  2. Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
  3. Birket, M. J., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors–a developmental perspective. Biologia do Desenvolvimento. 400 (2), 169-179 (2015).
  4. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
  5. Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
  6. Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
  7. Galdos, F. X., et al. Cardiac Regeneration: Lessons From Development. Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).
  8. Lescroart, F., et al. Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development. Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).
  9. Bruneau, B. G. Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).
  10. Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).
  11. Bruneau, B. G., et al. Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome. Biologia do Desenvolvimento. 211 (1), 100-108 (1999).
  12. Watanabe, Y., et al. Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).
  13. Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field. Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).
  14. Zhou, Z., et al. Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease. Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).
  15. Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
  16. Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).
  17. Bruneau, B. G., Srivastava, D. Congenital heart disease: entering a new era of human genetics. Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).
  18. Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).
  19. Li, L., et al. HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle. International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).
  20. Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
  21. Uosaki, H., et al. Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).
  22. Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).
  23. Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, 02164 (2014).
  24. Morita, Y., et al. Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).
  25. Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).
  26. Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326 (5951), 426-429 (2009).

Play Video

Citar este artigo
Tampakakis, E., Miyamoto, M., Kwon, C. In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (149), e59826, doi:10.3791/59826 (2019).

View Video