In Vitro Generación de Células Progenitoras Cardíacas específicas de Mouse Field
Summary
El propósito de este método es generar células progenitoras cardíacas específicas del campo cardíaco in vitro con el fin de estudiar la especificación de la célula progenitora y las propiedades funcionales, y para generar células cardíacas específicas de la cámara para el modelado de enfermedades del corazón.
Abstract
Las células madre pluripotentes ofrecen un gran potencial para entender el desarrollo del corazón y las enfermedades y para la medicina regenerativa. Si bien los recientes avances en la cardiología del desarrollo han llevado a generar células cardíacas a partir de células madre pluripotentes, no está claro si los dos campos cardíacos -el primer y segundo campo cardíaco (FHF y SHF)- se inducen en sistemas de células madre pluripotentes. Para abordar esto, generamos un protocolo para la especificación in vitro y el aislamiento de células progenitoras cardíacas específicas del campo cardíaco. Utilizamos líneas de células madre embrionarias que llevan Hcn4-GFP y Tbx1-Cre; Los reporteros de Rosa-RFP de la FHF y la SHF, respectivamente, y la inmunomancha de células vivas de la proteína de membrana celular Cxcr4, un marcador de SHF. Con este enfoque, generamos células progenitoras que recapitulan las propiedades funcionales y el transcriptoma de sus contrapartes in vivo. Nuestro protocolo se puede utilizar para estudiar la especificación temprana y la segregación de los dos campos cardíacos y para generar células cardíacas específicas de la cámara para el modelado de enfermedades cardíacas. Dado que se trata de un sistema organoide in vitro, es posible que no proporcione información anatómica precisa. Sin embargo, este sistema supera la escasa accesibilidad de los embriones en etapa de gastrulación y se puede ampliar para pantallas de alto rendimiento.
Introduction
El uso de células madre pluripotentes (PSC) ha revolucionado el campo de la regeneración cardíaca y la medicina personalizada con miocitos específicos del paciente para el modelado de enfermedades y terapias farmacológicas1,2,3, 4. Más recientemente, se han desarrollado protocolos in vitro para la generación de cardiomiocitos derivados de la PSC auricular es adictivo y similares a marcapasos, 5,6. Sin embargo, aún no está claro si la cardiogénesis puede recrearse in vitro para estudiar el desarrollo cardíaco y, posteriormente, generar células cardíacas específicas de la cámara ventricular.
Durante el desarrollo embrionario temprano, las células mesodérmicas bajo la influencia de morógenos secretados como BMP4, Wnts y Activin A forman la racha primitiva7. Células mesodermales cardíacas marcadas por la expresión de Mesp1, migran antes y más bien para formar la media luna cardiaca y luego el tubo cardíaco primitivo7,8. Este grupo migratorio de células incluye dos poblaciones muy distintas de células progenitoras cardíacas (CPC), a saber, el primer y segundo campo cardíaco (FHF y SHF)9,10. Las células del SHF son altamente proliferativas y migratorias y son las principales responsables del alargamiento y bucle del tubo cardíaco. Además, las células SHF se diferencian a cardiomiocitos, fibroblastos, músculo liso y células endoteliales a medida queentran en el tubo cardíaco para formar el ventrículo derecho, tracto de salida ventricular derecha y gran parte de ambas aurículas 7,10. Por el contrario, las células FHF son menos proliferativas y migratorias y se diferencian principalmente a los cardiomiocitos, ya que dan lugar al ventrículo izquierdo y a una parte más pequeña de la aurícula11. Además, los progenitores SHF están marcados por la expresión de Tbx1, FGF8, FGF10 y Six2, mientras que las células FHF expresan Hcn4 y Tbx511,12,13,14,15.
Los PSC pueden diferenciarse a las tres capas germinales y posteriormente a cualquier tipo de célula en el cuerpo4,16. Por lo tanto, ofrecen un enorme potencial para entender el desarrollo del corazón y para modelar defectos específicos del desarrollo que resultan en enfermedades cardíacas congénitas, la causa más frecuente de defectos congénitos17. Un gran subgrupo de cardiopatía congénita incluye anomalías cardíacas específicas de la cámara18,19. Sin embargo, todavía no está claro si estos se originan en el desarrollo anómalo del campo del corazón. Además, dada la incapacidad de los cardiomiocitos para proliferar después del nacimiento, se han realizado grandes esfuerzos para crear tejido cardíaco para la regeneración cardíaca1,7,20. Teniendo en cuenta las diferencias fisiológicas y morfológicas entre las cámaras cardíacas, la generación de tejido cardíaco específico de la cámara utilizando PsCs es de importancia significativa. Si bien los recientes avances en cardiología del desarrollo han llevado a una generación robusta de células cardíacas a partir de PSC, todavía no está claro si los dos campos cardíacos pueden ser inducidos en los sistemas PSC.
Para recapitular la cardiogénesis in vitro y estudiar las especificaciones y propiedades de los CPC, anteriormente utilizamos un sistema basado en la diferenciación de esferoides cardíacos derivados de PSC21,22,23,24. Recientemente, generamos células madre embrionarias de ratón (mESC) con reporteros de GFP y RFP bajo el control del gen DeFHcn4 y el gen SHF Tbx1, respectivamente (mESCsTbx1-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP) 25. Los mESC diferenciados in vitro formaron esferoides cardíacos en los que las células GFP+ y RFP+ aparecieron de dos áreas distintas de células mesodeérmicas y se modelaron de manera complementaria. Las células GFP+ y RFP+ resultantes mostraron características de FHF y SHF, respectivamente, determinadas por la secuenciación del ARN y los análisis clonales. Es importante destacar que, utilizando mESC que transporta el reportero Isl1-RFP (mESCIsl1-RFP),descubrimos que las células SHF estaban marcadas fielmente por la proteína de superficie celular CXCR4, y esto puede permitir el aislamiento de células específicas del campo cardíaco sin transgenes. El presente protocolo describirá la generación y el aislamiento de cPC específicos en el campo cardíaco de los mESC, que pueden servir como una herramienta valiosa para estudiar las cardiopatías específicas de la cámara.
Protocol
Representative Results
Discussion
En nuestro protocolo, describimos una metodología para generar esferoides cardíacos y CPC específicos del campo cardíaco aislado. Estos se pueden utilizar para estudiar los mecanismos de especificación de CPC y sus propiedades, así como para el modelado de enfermedades específicas de la cámara cardíaca. Un trabajo publicado anteriormente utilizó una línea mESC con dos reporteros fluorescentes (Mef2c/Nkx2.5) para estudiar cardiogénesis in vitro, sin embargo, ambos marcadores se expresan en el día embrionario …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E. T. fue apoyado por The Magic That Matters y AHA. C. K. fue apoyado por las concesiones de NICHD/NIH (R01HD086026), AHA y MSCRF.
Materials
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 0.1% (w/v) Gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | |
| 100mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| 100X Pen/Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 1X PBS w/o Calcium and Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21-040-CV | |
| 20% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-493 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer | BD Falcon | 35223 | |
| Activin A | R & D Systems | 338-AC-010 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-4544 | |
| B27 minus vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BMP4 | R & D Systems | 314-BP | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Cell sorter | Sony | SH800 | Sony or any other fluorescence-activated cell sorter |
| Cell strainer 70μm | Thermo Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Centrifuge Sorvall Legend XT | Thermo Fisher Scientific | 75004508 | |
| CHIR99021 | Selleck chemicals | S2924 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51030285 | |
| Corning Ultra Low Attachment T75 flask | Corning | 07-200-875 | |
| Countless II FL automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-31571, Lot #1757130 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| ESGRO (LIF) | Millipore | ESG1106 | |
| EVOS FL microscope | Thermo Fisher Scientific | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | SH30071.03 | |
| Glasgow’s MEM (GMEM) | Gibco | 11710035 | |
| GlutaMAX (100 x) | Gibco | 35050-061 | |
| Ham’s F12 | Gibco | 10-080-CV | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Monothioglycero (MTG) | Sigma | M-6145 | |
| Mouse anti-Troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific | MS-295-P1 | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acid solution (NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody | Thermo Fisher Scientific | 46-9991-82 | |
| Suspension culture dish 150 mm x 25mm | Corning | 430597 | |
| T25 flasks | Corning | 353109 | |
| TrypLE (Trypsin) | Gibco | 12604 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Stem cell technologies | 72304 |
Referências
- Laflamme, M. A., Murray, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
- Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Birket, M. J., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors–a developmental perspective. Biologia do Desenvolvimento. 400 (2), 169-179 (2015).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
- Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
- Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
- Galdos, F. X., et al. Cardiac Regeneration: Lessons From Development. Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).
- Lescroart, F., et al. Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development. Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).
- Bruneau, B. G. Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).
- Bruneau, B. G., et al. Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome. Biologia do Desenvolvimento. 211 (1), 100-108 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).
- Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field. Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).
- Zhou, Z., et al. Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease. Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).
- Bruneau, B. G., Srivastava, D. Congenital heart disease: entering a new era of human genetics. Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).
- Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).
- Li, L., et al. HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle. International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
- Uosaki, H., et al. Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, 02164 (2014).
- Morita, Y., et al. Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).
- Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326 (5951), 426-429 (2009).
