このプロトコルの目的は、せん断応力によるメカノ感受性イオンチャネルのリアルタイム活性化を調査する上で使用する改変並列プレートフローチャンバを記述することです。
流体せん断応力は、内皮機能において大きな役割を果たすることがよく知られている。ほとんどの血管床では、血流の急激な増加によるせん断ストレスの上昇は、血管拡張を引き起こし、それによって血管壁の機械的ストレスを緩和するシグナル伝達カスケードを引き起こす。せん断ストレスのパターンは、層せん断ストレスがアテローム保護および乱れたせん断ストレスがプロアトロジェニックであるアテローム性動脈硬化症の発症の重要な要因であることもよく知られている。様々な中間細胞シグナル伝達経路を詳しく理解していますが、最初に機械的刺激を化学メディエーターに変換する受容体は完全には理解されていません。メカノ感受性イオンチャネルは、せん断に対する応答に不可欠であり、それによって血管活性メディエーターの産生を制御するせん断誘発細胞シグナル伝達を調節する。これらのチャネルは、せん断する最も初期の活性化シグナル伝達成分の一部であり、一酸化窒素産生を促進することによりせん断誘発性血管拡張にリンクされている(例えば、内側に整流K +[Kir]および一過性受容体電位[TRP]チャネル)および内皮過分極因子(例えば、Kirおよびカルシウム活性化K+[KCa]チャネル)およびピエゾチャネルを含む未決定のメカニズムを介してせん断誘発血管収縮。これらのチャネルがせん断力(すなわち、直接または一次メカノ受容体を介して)によって活性化される生物物理学的メカニズムを理解することは、内皮機能障害に関連する病態生理学を解決するための潜在的な新しい標的を提供する可能性があるそしてアテロジェネシス。電気生理学を用いて、イオンチャネルの流れ誘発活性化をリアルタイムで記録することは、依然として大きな課題です。円盤とプレートレオメータや閉じた平行プレートフローチャンバなど、明確に定義されたせん断応力に細胞をさらす標準的な方法では、イオンチャネル活性化のリアルタイム調査はできません。このプロトコルの目的は、明確に定義されたせん断応力の下でメカノセンシティブイオンチャネルのリアルタイム電気生理学的記録を可能にする修正された並列プレートフローチャンバを記述することです。
血流によって発生する血行力は、内皮および血管機能1、2において主要な役割を果たすることがよく知られている。また、いくつかのタイプのイオンチャネルがせん断応力3、4、5の変化に鋭く反応し、イオンチャネルが一次せん断応力センサになりうするという仮説を導くこともよく知られている。最近では、我々と他の人は、メカノ感受性イオンチャネルがせん断ストレス6、7、8に対する血管活性応答を含むいくつかのせん断ストレス感受性血管機能において重要な役割を果たすことを示した。、および発達血管新生9.しかし、イオンチャネルのせん断応力感受性のメカニズムはほとんど全く知られていない。この知識のギャップは、明確に定義されたせん断応力の下で電気生理学的記録を行うことの技術的な困難に起因する可能性が高い。したがって、この記事では、この目標6、7、10、11を達成するためにラボで日常的に実行される詳細なプロトコルを段階的に提供します。
この方法の全体的な目標は、生理学的範囲で明確に定義されたせん断ストレスの下でイオンチャネルメカノ活性化のリアルタイム調査を可能にすることです。これは、標準的な並列プレートフローチャンバを変更して、電気生理学的ピペットをチャンバ内に下げ、リアルタイムの流量の間に底板上で成長した細胞にアクセスできるようにすることで達成され、これを達成するためのユニークなアプローチを提供します。ゴール6,7,11.対照的に、以前の出版物に記載されている標準的な並列板流れ室は、せん断力12または他の非侵襲的アプローチ13、14に曝露された細胞のリアルタイムイメージング分析に使用することができるが、以下の場合には使用できない。電気 生理 学。同様に、コーン及び板装置は、せん断応力15、16に細胞を露出させる別の強力なアプローチも電気生理学的記録には適していない。したがって、これらの流れ装置は、イオンチャネルのせん断応力感度の調査を可能にしない。流れの下で電気生理学的記録を行うことの難しさは、これらの重要な効果を担当するメカニズムに関する情報の貧弱さの主な理由です。
同じ目標を達成するための代替アプローチに関しては、正確または制御されているものはありません。いくつかの以前の研究は、17、18の上から細胞の近くに持って来た別のピペットから来る液体の流れに細胞を露出することによって、流れの下でイオンチャネル活性を記録しようとしました。これらの条件下で発生する機械的力は、血管内のせん断ストレスの生理学的プロファイルとほとんど共通点を持たないため、これは非常に非生理学的である。同様の懸念は、開いているチャンバーの灌流によって生理的せん断ストレスをシミュレートする試みに適用されます。我々の以前の研究10で詳しく説明したように、開いた液体空気界面は、非生理学的である複数の妨害および再循環を作成する。これらすべての懸念に対処するために、我々は、我々の以前の研究6、7、10、11で「最小限に侵略的な流れ装置」とも呼ばれる修正された平行板(MPP)フローチャンバーを設計しました。アクリルから、私たちの研究室で広く使用されています。しかし、設計の元の説明はほぼ20年前に公開されており、明確に定義されたせん断応力の下で電気生理学的記録を行うことを可能にする唯一のフローデバイスであるという事実にもかかわらず、この方法論は行われていなかった。他のラボで採用され、流れの下で電流を記録しようとする研究はごくわずかです。したがって、MPPフローチャンバーを使用するための詳細な説明を提供することは、メカノ感受性イオンチャネルおよび血管生物学に興味を持っている研究に大きな助けになると信じています。
血管系は常に活発な血行力にさらされ、メカノ感受性イオンチャネル3、22を活性化するが、せん断ストレス誘発メカノトランスダクションにおけるこれらのチャネルの生理的役割は、唯一の出現し始める 4,6,8.せん断応力活性化チャネルのメカノ感受性を担うメカニズムは未知の…
The authors have nothing to disclose.
この研究は、国立心臓、肺、血液研究所(R01 HL073965、IL)および(T32 HL07829-24、ISF)によって資金提供されました。著者らはまた、私たちの最新のMPPフローチャンバーを生成するために、シカゴのイリノイ大学の科学機械ショップを認めたいと思います。
0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
24 x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
24 x 50 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
20 gauge syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg – LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg – LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg – LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |