잘 정의된 전단 응력 하에서 단세포 이온 전류의 전기 생리학적 기록
Summary
이 프로토콜의 목적은 전단 응력에 의한 메카노민성 이온 채널의 실시간 활성화를 조사하는 데 사용하기 위해 변형된 병렬 플레이트 플로우 챔버를 설명하는 것이다.
Abstract
유체 전단 응력은 내피 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있다. 대부분의 혈관 침대에서, 혈류의 급성 증가에서 높은 전단 스트레스는 혈관 확장의 결과로 신호 캐스케이드를 트리거하여 혈관 벽에 기계적 스트레스를 완화. 전단 응력의 패턴은 또한 잘 친동맥질성인 전단 응력과 함께 동맥경화증의 발달에 중요한 요인으로 알려져 있다. 우리는 다양한 중간 세포 신호 경로의 상세한 이해가 있는 동안, 화학 매개체로 기계적인 자극을 첫째로 번역하는 수용체는 완전히 이해되지 않습니다. 메카노민성 이온 채널은 전단 및 조절 전단 유도 세포 신호에 대한 반응에 매우 중요하며, 이에 따라 혈관활성 매개체의 생산을 조절한다. 이러한 채널은 전단에 가장 초기 활성화 된 신호 성분 중 이며 산화 질소 생산을 촉진 을 통해 전단 유도 혈관 확장에 연결 되었습니다 (예를 들어, 안쪽으로 정류 K+ [Kir] 및 과도 수용 체 잠재력 [TRP] 채널) 및 내피 과분극 인자(예를 들어, Kir 및 칼슘 활성화 K+ [KCa] 채널) 및 압전 채널을 수반하는 결정되지 않은 메커니즘을 통해 전단 유도 혈관 수축. 이러한 채널이 전단력에 의해 활성화되는 생물 물리학 적 메커니즘을 이해 (즉, 직접 또는 기본 메카노 수용체를 통해) 내피 기능 장애와 관련된 병리 생리학을 해결하기 위해 잠재적 인 새로운 목표를 제공 할 수 그리고 아히로제네시스. 전기 생리학을 사용하여 실시간으로 이온 채널의 흐름 유도 활성화를 기록하는 것은 여전히 주요 과제입니다. 원뿔 및 플레이트 레오미터 및 폐쇄형 평행 플레이트 유량챔버와 같이 셀을 잘 정의된 전단 응력에 노출하는 표준 방법은 이온 채널 활성화에 대한 실시간 연구를 허용하지 않습니다. 이 프로토콜의 목표는 잘 정의된 전단 응력 하에서 메카노감응이성 이온 채널의 실시간 전기생리학적 기록을 허용하는 변형된 병렬 플레이트 플로우 챔버를 설명하는 것입니다.
Introduction
혈류에 의해 생성되는 혈역학적 힘은 내피 및 혈관 기능1,2에서중요한 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있다. 또한 여러 유형의 이온 채널이 전단 응력 3,4,5의 변화에 급격하게 반응하여 이온 채널이 1차 전단 응력 센서가 될 수 있다는 가설을 세우고 있는 것으로 잘 알려져 있다. 최근에는, 저희와 다른 사람들은 메카노민성 이온 채널이 전단 스트레스에 대한 혈관 활성 반응을 포함하여 여러전단 스트레스 에 민감한 혈관 기능에 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었습니다 6,7,8 , 발달 혈관 신생9. 그러나 이온 채널의 전단 응력 감도 메커니즘은 거의 완전히 알려지지 않았습니다. 지식의 이 격차는 잘 정의된 전단 응력 하에서 전기 생리학적 기록을 수행하는 기술적 어려움 때문일 가능성이 높습니다. 이 문서에서는, 따라서, 우리는 이 목표를 달성하기 위하여 우리의 실험실에서일상적으로 수행되는 단계별 상세한 프로토콜6,7,10,11을제공합니다 .
이 방법의 전반적인 목표는 생리학적 범위에서 잘 정의된 전단 응력 하에서 이온 채널 메카노활성화의 실시간 조사를 허용하는 것이다. 이는 전기 생리학적 파이펫이 챔버내로 낮아질 수 있도록 표준 병렬 플레이트 유량 챔버를 수정함으로써 달성되며, 이를 달성하기 위한 독특한 접근법을 제공하는 동안 바닥 판상에서 성장된 접근 세포와 접근 셀을 목표6,7,11. 대조적으로, 이전 간행물에 기술된 표준 병렬 플레이트 유량 챔버는 전단력12 또는 기타 비침습적 접근법13,14에 노출된 세포의 실시간 이미징 분석을 위해 사용될 수 있지만, 그렇지 않은 경우 전기 생리학. 유사하게, 원뿔 및 플레이트 장치는, 전단 응력(15,16)에 세포를 노출시키기 위한 또 다른 강력한 접근법은 또한 전기생리학적 기록에 적합하지 않다. 따라서, 이러한 유동 장치는 이온 채널의 전단 응력 민감도의 조사를 허용하지 않는다. 흐름 하에서 전기 생리학적 기록을 수행하는 데 어려움은 이러한 중요한 효과를 담당하는 메커니즘에 대한 정보의 빈약성에 대한 주된 이유입니다.
동일한 목표를 달성하기 위한 대체 접근 법의 관점에서 정확하거나 제어되는 방법은 없습니다. 몇몇 이전 연구는17,18이상에서 세포의 부근에 가져온 다른 파이펫에서 오는 액체의 스트림에 세포를 노출시킴으로써 흐름의 밑에 이온 채널 활동을 기록하기 위하여 시도했습니다. 이것은 매우 비 생리적, 이러한 조건 하에서 생성 된 기계적 힘은 혈관에서 전단 스트레스의 생리적 프로필과 거의 공통점이 없기 때문에. 유사한 관심사는 열린 챔버의 관류에 의한 생리적 전단 응력 시뮬레이션 시도에 적용됩니다. 우리의 이전 연구 10에서자세히 설명한 바와 같이, 열린 액체 공기 인터페이스는 비 생리학적인 여러 장애 및 재순환을 만듭니다. 이러한 모든 문제를 해결하기 위해, 우리는 또한 우리의 이전 연구에서 “최소 침습 흐름 장치”라고 수정 병렬플레이트 (MPP) 흐름 챔버를 설계 6,7,10,11,만든 아크릴에서 광범위하게 우리의 실험실에서 사용. 그러나, 디자인의 원래 설명이 거의 20 년 전에 출판되었다는 사실에도 불구하고 잘 정의 된 전단 응력하에서 전기 생리학적 기록을 수행 할 수있는 유일한 흐름 장치입니다, 이 방법론은되지 않았습니다 다른 실험실에서 채택하고 흐름에서 전류를 기록하려고 시도하는 연구는 거의 없습니다. 따라서 MPP 유량챔버 사용에 대한 상세한 설명을 제공하는 것은 메카노민성 이온 채널 및 혈관 생물학에 관심이 있는 연구에 큰 도움이 될 것이라고 믿습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
혈관 계통은 지속적으로 활성 혈역학적 힘에 노출되어, 이는 메카노민성 이온 채널3,22를 활성화하지만 전단 스트레스 유발 메카노 트랜스덕션에서 이러한 채널의 생리적 역할은 단지 등장하기시작 4,6,8. 전단 응력 활성화 채널의 메카노민성을 담당하는 메커니즘은 아직 알려지지 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 심장에 의해 투자 되었다, 폐, 혈액 연구소 (R01 HL073965, 일리노이) 그리고 (T32 HL007829-24, ISF). 저자는 또한 우리의 최신 MPP 흐름 챔버를 생성하기위한 시카고 일리노이 대학의 과학 기계 가게를 인정하고 싶습니다.
Materials
| 0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
| 5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
| 9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
| 12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
| 24 x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
| 24 x 50 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
| 20 gauge syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| 35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
| collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg – LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
| elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg – LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
| Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
| neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg – LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
| SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
| Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |
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