다발성 경화증은 치료법이없는 염증성 탈수성 질환입니다. 뇌 조직의 분석은 질병의 발병 기전을 이해하는 중요한 단서를 제공합니다. 여기에서 우리는 클리블랜드 클리닉에서 운영하는 독특한 신속한 부검 프로그램을 통해 수집 된 MS 뇌 조직의 방법론 및 하류 분석에 대해 논의합니다.
우리는 다발성 경화증 (MS)를 가진 개별을 위한 급속한 조직 기증 프로그램을 기술합니다 과학자와 기술자는 24/7, 365 일 1 년에 대기할 것을 요구합니다. 참가자는 뇌와 척수를 기증하는 데 동의합니다. 대부분의 환자는 MS 처리 및 연구를 위한 클리블랜드 진료소 멜렌 센터에 신경학자에 의해 선행되었습니다. 그들의 임상 과정과 신경 장애는 잘 특성화되어 있습니다. 죽음 직후, 바디는 3 T 자기 공명 화상 진찰 (MRI)에 의해 두뇌가 그(것)들에서 검사되는 MS 화상 진찰 센터로 수송됩니다. 시신은 부검실로 옮겨져 뇌와 척수를 제거합니다. 뇌는 두 개의 반구로 나뉩니다. 한 반구는 즉시 슬라이스 상자에 배치하고 대체 1cm 두께의 슬라이스는 이틀 동안 4 % 파라 포름 알데히드에 고정되거나 드라이 아이스와 2 메틸 부탄에서 빠르게 얼어 붙습니다. 짧은 고정 된 뇌 조각은 동결 보존 용액에 저장되며 조직학적 분석 및 민감한 항원의 면역 세포 화학 적 검출에 사용됩니다. 냉동 슬라이스는 -80 °C에 저장되고 분자, 면역 세포 화학 및 현장에서 혼성화 / RNA 범위 연구에 사용됩니다. 다른 반구는 몇 달 동안 4 % 파라 포름 알데히드에 배치, 슬라이스 상자에 배치, 3 T 자기 공명 (MR) 스캐너에서 다시 스캔하고 센티미터 두께의 조각으로 슬라이스. SITU MR 이미지(MRI)의 사후 처리는 MRI-병리학 상관 관계를 용이하게 하기 위해 1cm 두께의 뇌 슬라이스와 공동 으로 등록되어 있습니다. 모든 뇌 조각은 촬영되고 뇌 백색 물질 병변이 확인됩니다. 척수는 2cm 세그먼트로 절단됩니다. 대체 세그먼트는 4% 파라포름알데히드 또는 급속냉동에 고정된다. postmortem MS 조직의 급속한 조달은 MS 두뇌 및 척수 및 두뇌 MRI 이상의 병리학적인 상관관계의 병리학적 및 분자 분석을 허용합니다. 이 급속하게 가공된 사후 조직의 질 (일반적으로 죽음의 6 시간 안에) MS 연구에 중대한 가치이고 많은 고충격 발견 귀착되었습니다.
질병을 연구하는 가장 좋은 방법 중 하나는 병에 걸린 조직 자체를 검사하는 것입니다. 이것은 중추 신경계 (CNS)의 질병을 공부하는 사람들에게 도전을 제시합니다. 병에 걸린 뇌와 척수의 생검은 극히 드물며 일반적으로 비정형 사례를 수반합니다. CNS 질병을 가진 개별을 위한 부검 비율은 최근에 극적으로 감소하고, 수행될 때, 수시로 조직의 급속한 조달을 제공하지 않습니다. 이러한 도전은 다발성 경화증 (MS)를 가진 개별에게서 조직을 수집에 집중된 몇몇을 포함하여 질병 중심의 두뇌 은행의 설치 귀착되었습니다. MS는 미엘린, 올리고엔드로시테스(미엘린 형성 세포), 뉴런 및 축삭을 파괴하는 중화민혈관의 염증 매개 질환입니다. MS 환자의 대다수는 결국 자연에서 퇴행성 가능성이 있는 점차적으로 진보적인 질병으로 발전하는 가변적인 복구를 가진 신경장애의 시합으로 시작하는이중 상이한 질병 과정이 1. 기증된 MS 두뇌의 대다수를 위해, 사후 처리 간격 (PMI) 죽음과 조직 처리 사이 24 h를 초과합니다. 이 조직은 MS 두뇌에 있는 병리학적인 변경에 관하여 귀중한 정보를 제공하더라도, 질병 병리생리학에 강력한 통찰력을 제공할 수 있는 더 진보된 분자 연구 결과적합하지 않습니다. 이것은 손상되지 않은 RNA를 요구하는 유전자 프로파일링 연구 결과를 위해 특히 케이스입니다.
위에서 설명한 한계를 극복하기 위해 MRI/병리학적 상관 관계를 허용하는 신속한 조직 기증 프로그램을 개발했습니다. 이 프로토콜은 현대 분자 연구에 적합한 잘 보존 된 조직을 제공하고 MS 뇌의 뇌 병리학 및 MRI 이상을 직접 비교할 수 있습니다. 클리블랜드 클리닉 다발성 경화증 조직 기증 프로그램은 20 년 이상 존재해 왔습니다. 이 급속한 조직 기증 프로그램은 MS 및 그밖 관련한 자기 면역 신경학상 조건을 가진 개별에게서 두뇌 그리고 척수를 조달합니다. 이 프로그램은 조직 처리를 위한 두뇌 및 척수의 제거에 선행된 죽음의 6 시간 안에 있는 situ MRI에서 장악하는 것을 목표로 합니다.
모집
기부금은 환자 (사전 동의)에서 직접 얻은 앤티 모템 동의를 통해 또는 사망 후 친척의 다음에서 얻어진다. 사전 동의된 환자는 전형적으로 클리블랜드, 오하이오에 있는 다발성 경화증 처리 및 연구를 위한 Mellen 센터에 임상 인구에서 확인됩니다. 급속한 조직 기증 프로그램에서 모집에 있는 특혜는 세로 연구 결과에서 따랐던 환자에게 주어지더라도, 센터에서 보인 모든 환자에게 열려 있습니다. 사망 전에 등록한 참가자는 사망 시 또는 사망이 임박한 것으로 생각될 때 가족 구성원 또는 의료 제공자에게 연구 팀에 연락할 수 있는 지침을 받습니다. 개인이 조직 기증 프로그램을 입력하는 두 번째 방법은 친척의 다음동의를 통해 사망시입니다. 오하이오 주는 오하이오 북동부 의 20 개 카운티에서 운영되는 LifeBanc라는 연방 정부가 위임 한 기관 조달 기관에 사망을 언급해야합니다. LifeBanc는 장기 기증을 위한 제외인 MS의 진단을 위한 모든 죽음을 스크린합니다. LifeBanc은 클리블랜드 클리닉에서 75 마일 반경 내에서 발생하는 MS의 관련 진단으로 모든 사망에 대한 MS 조직 기증 프로그램에서 수사관에게 알리기 위해 준비되었습니다. 다음 친척과 병원 직원은 조직 기증 프로그램 직원에 의해 연락을 받고 뇌및 척수 조직의 기증에 대한 동의를 얻습니다. LifeBanc을 통해 모집 앤티 모템과 사후 모템의 이 두 가지 방법은 연간 약 10-12 개의 뇌 기부를 초래합니다. LifeBanc에서 파생된 추천 수를 관리하기 위해 사망 연령 상한선을 조정합니다.
기부금 조달
이 프로그램은 조직 조달을위한 조직 기증 프로그램의 구성원에 의해 24 시간 범위, 365 일 년 을 필요로합니다. 중앙 조직 기증 알림 이메일 / 호출기 / 모바일 장치 텍스트 알림 시스템은 조직 기부를 포함하는 임상 팀에 의해 사용됩니다. LifeBanc은 조직 기증 프로그램을 위해 대기 직원에게 연락할 수 있는 번호를 제공합니다. 회원은 병원 제공자/친족(사전 동의) 또는 LifeBanc 및 기타 추천 출처에 의해 사망 사실을 통보받습니다. 첫째, 사망 시점과 조직 기증에 대한 타당성을 결정합니다. 죽음은 잠재적으로 가난한 품질의 조직귀착되는 조건에 대 한 스크리닝, 장기간된 pre-mortem 저산소증을 포함 하 여, 대규모 파괴적인 뇌 조직 (예를 들어, 큰 두 개 내 출혈, 광범위 한 bi-반 반 구 성 뇌졸중, 광범위 한 종양 장기간 인공호흡기 지원(>3일), 사망 전 혈관활성제(>3일) 장기간 사용. 의학 검사관이 죽음에 관여하는 경우에, 연구 신경학자는 의학 검사관의 책임을 손상시키지 않고 적시에 조직을 수신하는 쪽을 탐구하기 위하여 의학 검사관과 이야기할 수 있습니다. 실행 가능한 조직이 존재한다고 생각되면 서면 동의가 얻어지고 (사전 평가를 얻지 못하면) 신체 수송을 위한 준비가 이루어집니다. 이전에 계약된 사망자 운송 서비스는 클리블랜드 클리닉의 MRI 시설로 이동하기 위해 연락을 취합니다. 낮은 체온이 MRI 신호 특성의 변경과 관련이 있기 때문에 신체가 실온에 남아 있고 냉장에 배치되지 않도록주의를 기울입니다.
임상 이력
임상 병력은 MS의 진단에 대한 세부 사항을 포함, 증상의 발병, 사용 된 치료, 임상 및 파라 임상 테스트의 결과 (연상 잠재력, 뇌척수액 결과, 광학 일관성 단층 촬영), 다발성 경화증 기능성 복합 의료 기록(사용 가능한 경우)에서 수집되는 확장된 장애 상태 척도(EDSS; 실제 또는 추정), 다음 친척에 대한 직접 인터뷰. 전 모템 MRI도 수집됩니다.
우리는 MS를 가진 150명의 개별에게서 조직을 급속하게 조달하고 가공하기 위하여 이용된 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜의 중요한 특징은 조직을 활용하는 과학자도 프로토콜을 확립하고 조직 수집을 수행하는 것을 담당한다는 것입니다. 이것은 개별 연구 프로젝트의 과학적 요구를 충족시키는 유연성을 제공합니다. 이 프로토콜의 여러 측면은 유틸리티를 향상시킵니다. 환자는 일반적으로 그들의 많은 우리의 센터에 신경학자에 의해 선행되었기 때문에, 죽음의 앞에 잘 특성화됩니다. 중요한 단계는 다른 두뇌 은행에 비해 냉동 조직의 질을 증가 죽음 직후 조직 기증의 처리입니다. 이것은 조직학 및 면역 세포화학적 관측의 입증을 위해 필수적인 전사 및 번역 유전자 제품에 있는 변경을 기술하기에 있는 중대한 가치인 분자 연구 결과를 가능하게 합니다. 여러 사례에 걸쳐 형태학적/면역세포화학적 및 분자 데이터를 활용하면 결론의 신뢰성이 향상됩니다. 이것은 가장 대뇌 피질과 탈수근 해마의 신경 유전자 변화에 미토콘드리아 유전자 변화의 우리의 설명에 의해 설명된다. 새로운 유전자 프로파일링 프로토콜은 빠른 속도로 개발되고 있으며 우리 은행의 냉동 조직은 조직 및 단일 세포 분석을 위한 고품질 RNA를 제공해야 합니다.
우리의 프로토콜의 또 다른 가치있는 측면은 짧은 고정 뇌 조각입니다. 이 조직은 30 μm 두께의 자유 부동 섹션으로 절단됩니다. 이 단면도는 공초점 현미경 검사법을 사용하여 3차원으로 2개 이상의 항원을 분석하기 위해 이상적입니다. 좋은 예로는 만성 MS 병변의 영양 실조 축삭과 사전 골수성 올리고드로시트 프로세스의 상호 작용뿐만 아니라 transected 축삭 수축 전구에 대한 단일 축삭 연결의 식별이 포함됩니다. 이는 3D 이미지가 실현 불가능한 7μm 두께의 파라핀 섹션을 일상적으로 사용하는 것과는 대조적입니다. 파라핀 내장 된 조직은 몇 가지 질문, 특히 반구형 7 μm 두께의 섹션에서 신경 밀도의 정량화에 큰 가치를 가지고 있습니다. 따라서 당사의 조직 처리 프로토콜은 다양하며 고정 및 급속 냉동 조직을 보장할 수 있는 유연성을 제공합니다.
우리의 프로토콜의 또 다른 독특한 특징은 situ 뇌 MRI의 사후 분석입니다. 뇌 MRI는 MS 질병의 대체 할 수없는 바이오 마커입니다. 따라서 비정상적인 MRI 신호의 병리학적 상관 관계를 확립하는 것이 필수적입니다. 우리의 연구는 T2 만 T2와 T2T1MTR ROI가 수시로 myelinated 된다는 것을 것을을 확립했습니다. 이 발견은 myelinated와 탈수초 된 대뇌 백색 물질을 안정적으로 구별하는 보다 구체적인 이미징 양식의 필요성을 뒷받침합니다. MRI는 myelin의 검출을 위해 과민한 것처럼 보이지만, 우리의 연구 결과는 T1/T2/MTR의 조합조차 균수레를 확인하기 위한 특정이 아니라는 것을 보여줍니다. 우리의 사후 프로토콜은 myelinated 및 demyelinated 대뇌 백색 물질을 구별하는 새로운 화상 진찰 양식의 기능을 시험하기위한 이상적인 플랫폼을 제공합니다. MRI는 또한 우리의 번역 연구에서 MRI의 사용과 살아있는 환자에서 의 광범위한 임상 사용을 감안할 때, 임상 연습으로 기초 과학 결과의 번역을위한 이상적인 차량을 제공합니다.
단가 및 긴 고정 및 냉동 슬라이스를 절단하는 동안 다른 연구에 대한 여러 모드에서 조직을 처리하는 이점을 제공하지만,이 방법에는 몇 가지 제한사항이 있습니다. 구조의 전체를 평가하는 것은 인접 한 슬라이스에 다르게 처리 될 수 있기 때문에 제한 될 수 있습니다. 조직 은행의 큰 볼륨, 그러나, 샘플링을 개선하기 위해 여러 과목에 관심의 구조를 조사 할 수있는 능력을 제공합니다. 사후 조직을 활용하는 연구에 대한 또 다른 일반적인 제한은 단면이라는 것입니다. 변경 의 시기와 진행에 관한 결론은 이 맥락에서 해석되어야 합니다. MS를 가진 모든 환자에게 데이터의 일반화를 제한할 수 있는 그들의 조직을 기증하는 환자에게 선택 편향이 있을지도 모릅니다. 대부분의 기증자는 향상된 MS의 합병증때문에 정지하기 때문에, MS의 초기 단계에 있는 사람들에 이 환자에게서 사실 인정을 추정하는 것은 적절하지 않을 지도 모릅니다. 그럼에도 불구하고, 우리는 비 MS 관련 조건 (즉, 급성 심근 경색, 약물 과다 복용, 자살)에서 사망 한 젊은 환자로부터 조직을 받았습니다. 우리의 프로토콜의 범위는 MS에 연루 된 다른 장기 (예를 들어, 위장 및 골수)의 샘플링을 포함하지 않습니다. 우리는 프로그램의 강점이 그 한계보다 훨씬 중요하다고 믿습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 또한 크리스토퍼 넬슨 박사에게 편집의 도움을 주셔서 감사드립니다. 부검 프로그램은 BDT에 R35 교부금 NS097303에 의해 부분적으로 지원됩니다. RD의 실험실에서 일은 NINDS (NS096148)와 미국 국립 다발성 경화증 학회 (RG 5298)의 보조금에 의해 지원됩니다.
Antibodies | |||
Biotinylated goat anti-mouse IgG | Vector Laboratories | BA-9200 | 1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30µm free-floating. RRID: AB_2336171 |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | BA-1000 | 1:500 dilution. |
Biotinylated goat anti-rat IgG | Vector Laboratories | BA-9400 | 1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30µm free-floating. RRID: AB_2336208 |
Glial fibrillary acid protein (GFAP) | Dako | Z0334 | 1:700 dilution for hemispheric. RRID: AB_10013382 |
HuR, mouse IgG, 3A2 clone | Santa Cruz | SC-5261 | 1:500 for 30µm free floating. RRID: AB_627770 |
Major histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43 | Dako | Mo746 | 1:250 dilution for hemispheric; 1:500 for 30µm free floating. RRID: AB_2313661 |
Non-phosphorylated neurofilament (SMI32) | Biolegend | 801701 | 1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30µm free-floating. RRID: AB_2564642 |
Phosphorylated neurofilament (SMI31) | Biolegend | 801601 | 1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30µm free-floating. RRID: AB_2564641 |
Proteolipid protein (PLP) | Gift from Wendy Macklin | 1:250 dilution for IHC; alternative anti-PLP antibodies commercially available. | |
Reagents | |||
125 mm filter paper | Whatman | 1452-125 | For filtering PFA. |
50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | Electron microscopy grade. |
Cytoseal | ThermoScientific | 8310-16 | |
Ethylene glycol | Fisher Chemical | BP230-4 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | 400mL/2L Cryoprotection solution. |
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore-Sigma | SLHV033RB | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19200 | Prills form. |
Polyvinylpyrolidone (PVP-40) | Fisher Chemical | BP220-212 | |
Sodium azide | Fisher Chemical | S227I | 2g/2L Sorenson's buffer. |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S0876 | 98.8g/2L Sorenson's buffer. |
Sodium phosphate mono basic monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | 14.352g/2L Sorenson's buffer. |
Sucrose | Sigma-Aldrich | PVP40-500G | |
VectaStain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | 1:1000 dilution of A and B. RRID: AB_2336819 |
Waterproof drawing black ink | Higgins | 44201 | |
Xylene | Fisher Chemical | X3S | Histological grade. |
Equipment | |||
3T MRI Magnetom Prisma | Siemens Healthineers | ||
7T MRI Agilent 830AS | Siemens Healthineers |