La sclerosi multipla è una malattia demielinante infiammatoria senza cura. L’analisi del tessuto cerebrale fornisce importanti indizi per comprendere la patogenesi della malattia. Qui discutiamo la metodologia e l’analisi a valle del tessuto cerebrale MS raccolti attraverso un programma di autopsia rapida unico in funzione presso la Cleveland Clinic.
Descriviamo un programma di donazione rapida di tessuti per persone con sclerosi multipla (MS) che richiede che scienziati e tecnici siano disponibili 24 ore su 24, 7 giorni su 7, 365 giorni all’anno. I partecipanti acconsentono a donare il loro cervello e il midollo spinale. La maggior parte dei pazienti è stata seguita da neurologi presso il Cleveland Clinic Mellen Center for MS Treatment and Research. I loro corsi clinici e le disabilità neurologiche sono ben caratterizzati. Poco dopo la morte, il corpo viene trasportato al MS Imaging Center, dove il cervello viene scansionato in situ da 3 T risonanza magnetica imaging (MRI). Il corpo viene quindi trasferito nella stanza dell’autopsia, dove vengono rimossi il cervello e il midollo spinale. Il cervello è diviso in due emisferi. Un emisfero viene immediatamente collocato in una scatola di affettare e fette alternate spesse 1 cm sono fissate in paraformaldeide del 4% per due giorni o congelate rapidamente nel ghiaccio secco e nel metilbutane 2. Le fette cerebrali fisse brevi vengono conservate in una soluzione di crioconservazione e utilizzate per analisi istologiche e rilevamento immunocitochimico di antigeni sensibili. Le fette congelate sono conservate a -80 gradi centigradi e utilizzate per studi molecolari, immunocitochimici e di ibridazione/RNA in situ. L’altro emisfero è posto in paraformaldeide del 4% per diversi mesi, posto nella scatola di taglio, ri-scansionato nello scanner a risonanza magnetica 3 T (MR) e tagliato a fette di centimetro di spessore. Le immagini MR (MR) postmortem in situ (MRI) sono registrate con fette cerebrali spesse 1 cm per facilitare le correlazioni RM-patologica. Tutte le fette di cervello sono fotografate e vengono identificate le lesioni della materia bianca del cervello. Il midollo spinale è tagliato in segmenti di 2 cm. I segmenti alternati sono fissati in paraformaldeide del 4% o congelati rapidamente. Il rapido approvvigionamento di tessuti MS postmortem consente analisi patologiche e molecolari del cervello e dei midollo spinale e correlazioni patologiche delle anomalie della risonanza magnetica cerebrale. La qualità di questi tessuti postmortem rapidamente elaborati (di solito entro 6 h dalla morte) è di grande valore per la ricerca sulla SM e ha portato a molte scoperte ad alto impatto.
Uno dei modi migliori per studiare una malattia è quello di esaminare il tessuto malato stesso. Questo presenta sfide a coloro che studiano le malattie del sistema nervoso centrale (SNC). Le biopsie del cervello e del midollo spinale malati sono estremamente rare e di solito coinvolgono casi atipici. I tassi di autopsia per gli individui affetti da malattie del SNC sono diminuiti drasticamente negli ultimi anni e, se eseguiti, spesso non forniscono un rapido approvvigionamento di tessuti. Queste sfide hanno portato alla creazione di banche cerebrali centrate sulla malattia, tra cui diverse si sono concentrate sulla raccolta di tessuti da individui con sclerosi multipla (MS). La SM è una malattia infiammatoria mediata del SNC che distrugge la mielina, gli oligodendrociti (cellule formanti mielina), i neuroni e gli assoni. La maggior parte dei pazienti affetti da SM ha un decorso della malattia bi-fasica che inizia con bout di disabilità neurologica con recupero variabile che alla fine si evolve in una malattia gradualmente progressiva che è probabilmente neurodegenerativa in natura1. Per la maggior parte dei cervelli smstatunitensi donati, gli intervalli post-mortem (PMI) tra la morte e l’elaborazione dei tessuti superano i 24 ore. Mentre questi tessuti hanno fornito informazioni preziose per quanto riguarda i cambiamenti patologici nel cervello ms, non sono adatti per studi molecolari più avanzati che possono fornire potenti informazioni sulla fisiopatologia della malattia. Ciò è particolarmente vero per gli studi di profilazione genica, che richiedono RNA intatto.
Per superare i limiti di cui sopra, abbiamo sviluppato un programma di donazione rapida dei tessuti che consente la risonanza magnetica / correlazioni patologiche. Questo protocollo fornisce tessuti ben conservati adatti per moderni studi molecolari e consente il confronto diretto della patologia cerebrale e delle anomalie della risonanza magnetica nei cervelli della SM. Il programma di donazione di tessuti per la sclerosi multipla Cleveland è in vigore da oltre 20 anni. Questo programma di donazione rapida di tessuti procura cervelli e midollo spinale da individui con SM e altre condizioni neurologiche autoimmuni associate. Il programma mira ad ottenere risonanze magnetiche in situ entro 6 h dalla morte, seguite dalla rimozione del cervello e del midollo spinale per l’elaborazione dei tessuti.
arruolamento
Le donazioni sono ottenute tramite il consenso ante mortem ottenuto direttamente da pazienti (pre-aconsentiti) o dai parenti prossimi dopo la morte. I pazienti pre-consentiti sono tipicamente identificati dalla popolazione clinica presso il Mellen Center for Multiple Sclerosis Treatment and Research di Cleveland, Ohio. Anche se la preferenza nel reclutamento nel programma di donazione rapida dei tessuti è data ai pazienti che sono stati seguiti in studi di ricerca longitudinali, è aperto a tutti i pazienti visti al centro. Ai partecipanti che si iscrivono prima della morte vengono date istruzioni affinché i membri della famiglia o i fornitori di assistenza contattino il team di ricerca, al momento della morte o quando si ritiene che la morte sia imminente. Il secondo metodo per gli individui di entrare nel programma di donazione di tessuti è al momento della morte per consenso da parte dei parenti prossimi. Lo Stato dell’Ohio richiede che i decessi siano deferiti a un’organizzazione di approvvigionamento di organi con mandato federale chiamata LifeBanc, che opera in 20 contee dell’Ohio nord-orientale. LifeBanc esamina tutti i decessi per una diagnosi di SM, che è un’esclusione per la donazione di organi. Sono stati presi accordi per LifeBanc per informare gli investigatori del programma di donazione di tessuti MS per tutti i decessi con una diagnosi associata di SM che si verificano entro un raggio di 75 miglia dalla Cleveland Clinic. I parenti e il personale ospedaliero vengono quindi contattati dal personale del programma di donazione dei tessuti e il consenso viene ottenuto per la donazione di tessuti cerebrali e del midollo spinale. Questi due metodi di reclutamento ante-mortem e post-mortem attraverso LifeBanc si traducono in circa 10-12 donazioni cerebrali all’anno. Vengono apportate modifiche al limite massimo di età superiore di decesso per gestire il numero di referral derivati da LifeBanc.
Acquisto di donazioni
Il programma richiede una copertura di 24 ore, 365 giorni all’anno da parte dei membri del programma di donazione dei tessuti per l’approvvigionamento dei tessuti. Un sistema centralizzato di notifica di donazione di tessuti/ cercapersone/dispositivo mobile viene utilizzato dal team clinico che copre le donazioni di tessuti. LifeBanc viene fornito numeri per contattare il personale di chiamata per il programma di donazione di tessuti. I membri sono informati della morte dai fornitori ospedalieri/parenti prossimi (pre-acconsentiti) o da LifeBanc e altre fonti di riferimento. In primo luogo, viene fatta una determinazione dell’ora del decesso e la fattibilità della donazione dei tessuti. I decessi vengono quindi sottoposti a screening per condizioni che potenzialmente si traducono in tessuto di scarsa qualità, tra cui ipossia pre-mortem prolungata, tessuto cerebrale distruttivo massiccio (ad esempio, grandi emorragie intracraniche, lunghi ictus biemisferici, supporto prolungato del ventilatore (>3 giorni) e uso prolungato di agenti vasoattivi (>3 giorni) prima della morte. Quando un esaminatore medico è coinvolto in una morte, il neurologo dello studio può parlare con il medico legale per esplorare un modo per ricevere tessuti tempestivi senza compromettere la responsabilità del medico legale. Se si ritiene che il tessuto vitale sia presente, si ottiene il consenso scritto (se non ottenuto prima della morte) e vengono preparati per il trasporto del corpo. Un servizio di trasporto ingedente precedentemente contratto viene quindi contattato per il trasporto alle strutture di risonanza magnetica presso la Cleveland Clinic. Si presta attenzione a garantire che il corpo rimanga a temperatura ambiente e non venga messo in refrigerazione, poiché le temperature inferiori del corpo sono associate ad alterazioni delle caratteristiche del segnale di risonanza magnetica.
Storia clinica
La storia clinica comprende dettagli sulla diagnosi della SM, l’insorgenza dei sintomi, i trattamenti utilizzati, i risultati dei test clinici e paraclinici (potenziali evocati, risultati del liquido cerebrospinale, tomografia di coerenza ottica), la sclerosi multipla composita funzionale , e l’espansione della scala dello stato di disabilità (EDSS; effettiva o stimata), che vengono raccolte dalla cartella clinica (ove disponibile) e dal colloquio diretto dei parenti prossimi. Vengono raccolte anche la risonanza magnetica pre-mortem.
Descriviamo un protocollo che è stato utilizzato per procurare ed elaborare rapidamente tessuti da oltre 150 individui con SM. Una caratteristica importante di questo protocollo è che gli scienziati che utilizzano il tessuto sono anche incaricati di stabilire il protocollo e di eseguire la raccolta dei tessuti. Ciò offre flessibilità nel soddisfare le esigenze scientifiche dei singoli progetti di ricerca. Diversi aspetti di questo protocollo ne migliorano l’utilità. I pazienti sono di solito ben caratterizzati prima della morte, poiché molti di loro sono stati seguiti da neurologi nel nostro centro. Un passo critico è l’elaborazione delle donazioni di tessuti subito dopo la morte, che aumenta la qualità del tessuto congelato rispetto ad altre banche cerebrali. Ciò consente studi molecolari di grande valore nel descrivere i cambiamenti nei prodotti genici trascrizionali e traslazionali, che sono essenziali per la giustificazione delle osservazioni istologiche e immunocitochimiche. L’utilizzo di dati morfologici/immunocitochimici e molecolari in più casi migliora l’affidabilità delle conclusioni. Questo è meglio illustrato dalla nostra descrizione dei cambiamenti genici mitocondriali nella corteccia cerebrale e nei cambiamenti dei geni neuronali negli ippocampi demielinati. Nuovi protocolli di profilazione genica sono in fase di sviluppo a un ritmo rapido e il tessuto congelato nella nostra banca dovrebbe fornire RNA di alta qualità per l’analisi dei tessuti e delle singole cellule.
Un altro aspetto apprezzato del nostro protocollo sono le fette cerebrali fisse brevi. Questi tessuti sono tagliati in sezioni di 30 m di spessore e galleggianti. Queste sezioni sono ideali per l’utilizzo della microscopia confocale per analizzare due o più antigeni in tre dimensioni. Buoni esempi includono l’interazione di processi oligodendrociti pre-mielinanti con assoni distrofici nelle lesioni croniche della SM, nonché l’identificazione di singole connessioni assonali ai bulbi di retrazione assonale transected. Questo è in contrasto con l’uso di routine di 7 sezioni di paraffina di spessore m, dove le immagini 3D non sono fattibili. I tessuti incorporati nella paraffina hanno un grande valore per alcune domande, in particolare la quantificazione delle densità neuronali nelle sezioni emisferiche 7 di m di spessore. I nostri protocolli di lavorazione dei tessuti, quindi, sono diversi e forniscono flessibilità per assicurare tessuti fissi e rapidamente congelati.
Un’altra caratteristica unica del nostro protocollo è la risonanza magnetica cerebrale post-mortem in situ. Le risonanze magnetiche cerebrali sono un biomarcatore insostituibile della malattia ms. È quindi essenziale stabilire le correlazioni patologiche dei segnali di risonanza magnetica anormali. I nostri studi hanno stabilito che sia T2 solo e T2T1MTR ROIs sono spesso mielinati. Questa scoperta supporta la necessità di modalità di imaging più specifiche che distinguano in modo affidabile tra materia bianca cerebrale mielinato e demielinato. La risonanza magnetica sembra essere sensibile per la rilevazione della mielina, ma i nostri studi dimostrano che anche una combinazione di T1/T2/MTR non è specifica per identificare la mielinazione. Il nostro protocollo postmortem fornisce una piattaforma ideale per testare la capacità di nuove modalità di imaging per distinguere tra materia bianca cerebrale mielinata e demielinata. La risonanza magnetica fornisce anche il veicolo ideale per la traduzione dei risultati scientifici di base nella pratica clinica, dato l’uso della risonanza magnetica nella nostra ricerca traslazionale e il suo uso clinico diffuso nei pazienti viventi.
Mentre il taglio di fette corte e lunghe fisse e congelate offre un vantaggio per la lavorazione del tessuto in più modalità per diversi studi, ci sono alcune limitazioni con questo metodo. La valutazione dell’intera struttura può essere limitata in quanto parti di essa possono essere elaborate in modo diverso su sezioni adiacenti. Il grande volume della banca dei tessuti, tuttavia, offre la capacità di studiare una struttura di interesse in più soggetti per migliorare il campionamento. Un’altra limitazione generale agli studi che utilizzano tessuti postmortem è che sono trasversali. Le conclusioni relative alla tempistica e alla progressione dei cambiamenti devono essere interpretate in questo contesto. Ci può essere un pregiudizio di selezione per i pazienti che donano i loro tessuti, che può limitare la generalizzazione dei dati a tutti i pazienti con SM. Poiché la maggior parte dei donatori muore a nome di complicazioni della SM avanzata, potrebbe non essere appropriato estrapolare i risultati da questi pazienti a quelli nelle fasi precedenti della SM. Tuttavia, abbiamo ricevuto tessuti da pazienti più giovani che sono morti per patologie non correlate alla SM (ad esempio, infarto miocardico acuto, sovradosaggio di droga, suicidio). L’ambito del nostro protocollo non comprende il campionamento di altri organi (ad esempio, il midollo gastrointestinale e osseo) che sono stati implicati nella SM. Crediamo che i punti di forza del programma superino di gran lunga i suoi limiti.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano anche ringraziare il Dr. Christopher Nelson per l’assistenza editoriale. Il programma di autopsia è supportato in parte dalla concessione di R35 NS097303 a BDT. Il lavoro nel laboratorio di RD è supportato da sovvenzioni del NINDS (NS096148) e della National Multiple Sclerosis Society, USA (RG 5298).
Antibodies | |||
Biotinylated goat anti-mouse IgG | Vector Laboratories | BA-9200 | 1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30µm free-floating. RRID: AB_2336171 |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | BA-1000 | 1:500 dilution. |
Biotinylated goat anti-rat IgG | Vector Laboratories | BA-9400 | 1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30µm free-floating. RRID: AB_2336208 |
Glial fibrillary acid protein (GFAP) | Dako | Z0334 | 1:700 dilution for hemispheric. RRID: AB_10013382 |
HuR, mouse IgG, 3A2 clone | Santa Cruz | SC-5261 | 1:500 for 30µm free floating. RRID: AB_627770 |
Major histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43 | Dako | Mo746 | 1:250 dilution for hemispheric; 1:500 for 30µm free floating. RRID: AB_2313661 |
Non-phosphorylated neurofilament (SMI32) | Biolegend | 801701 | 1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30µm free-floating. RRID: AB_2564642 |
Phosphorylated neurofilament (SMI31) | Biolegend | 801601 | 1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30µm free-floating. RRID: AB_2564641 |
Proteolipid protein (PLP) | Gift from Wendy Macklin | 1:250 dilution for IHC; alternative anti-PLP antibodies commercially available. | |
Reagents | |||
125 mm filter paper | Whatman | 1452-125 | For filtering PFA. |
50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | Electron microscopy grade. |
Cytoseal | ThermoScientific | 8310-16 | |
Ethylene glycol | Fisher Chemical | BP230-4 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | 400mL/2L Cryoprotection solution. |
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore-Sigma | SLHV033RB | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19200 | Prills form. |
Polyvinylpyrolidone (PVP-40) | Fisher Chemical | BP220-212 | |
Sodium azide | Fisher Chemical | S227I | 2g/2L Sorenson's buffer. |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S0876 | 98.8g/2L Sorenson's buffer. |
Sodium phosphate mono basic monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | 14.352g/2L Sorenson's buffer. |
Sucrose | Sigma-Aldrich | PVP40-500G | |
VectaStain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | 1:1000 dilution of A and B. RRID: AB_2336819 |
Waterproof drawing black ink | Higgins | 44201 | |
Xylene | Fisher Chemical | X3S | Histological grade. |
Equipment | |||
3T MRI Magnetom Prisma | Siemens Healthineers | ||
7T MRI Agilent 830AS | Siemens Healthineers |