这里介绍的多位数可变数串联重复分析(MLVA)测定使鱼类致病菌Yersinia ruckeri的廉价、坚固和便携式高分辨率基因分型成为可能。从纯培养基开始,该测定采用多路PCR和毛细管电泳,为下游应用生产十位MLVA型材。
耶尔西尼亚·鲁克里是全世界养殖鲑鱼的重要病原体,但缺乏适用于该细菌的流行病学调查(感染追踪等)的简单工具。因此,多位可变数串联重复分析 (MLVA) 测定被开发为一种易于访问且明确的工具,用于对回收的分离物进行高分辨率基因分型。对于此处介绍的MLVA测定,DNA通过在水中煮沸的细菌细胞从培养的Y.ruckeri样品中提取,然后使用上清液作为PCR的模板。以十个可变数串联重复(VNTR)位点为目标的引物对,穿插在整个Y.ruckeri基因组中,在相同的循环条件下运行的两个五丛PCR反应之间平均分布。前引种标有三种荧光染料中的任何一种。在凝胶电泳确认后,PCR产物被稀释并进行毛细血管电泳。从生成的电表图配置文件中,表示每个 VNTR 位点的峰值是大小调用的,用于计算硅中 VNTR 重复计数。然后,生成的十位 MLVA 轮廓用于生成最小生成树,以便通过聚类分析进行动物学评估。高度可移植的输出数据,以数字MLVA配置文件的形式,可以跨实验室快速比较,并放置在时空环境中。从培养菌群到动物疫病评估的整个过程可在一个工作日内完成多达48个Y.ruckeri分离物。
耶尔西尼亚·鲁克里,一种革兰氏阴性细菌和耶尔西尼亚人家族的成员,在全世界养殖鲑鱼中引起叶尔西尼病。它很容易通过在很多类型的琼脂培养中被感染的鱼类诊断出来,但直到最近,关于Y.ruckeri的人口结构和动物学,在全世界和不同生境(宿主物种等)中,鲜为人知。Y. ruckeri现有的血清分型系统不一致,缺乏相互兼容性,流行病学分辨率较低。对细菌进行了一些分子研究,采用多位序列打字(MLST)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)或全基因组序列(WGS)分析2、3、4等技术 , 5.然而,MLST不能为常规感染追踪提供足够高的分辨率,而PFGE需要人工,并且产生的结果不容易跨实验室移植。虽然WGS分析将提供一个接近最终的解决办法,但建立和实施这种分析将是技术和生物信息学能力的先决条件,而技术和生物信息学能力仍然局限于相对较少的实验室。
多位点可变数串联重复分析(MLVA)是一种简单易用的分子打字工具,在某些情况下提供基因分辨率几乎与WGS分析6,7的分辨率相匹配。该技术基于选定可变数串联重复 (VNTR) 位点的重复数变化,从而产生高度可传输的输出数据,因此将分析的隔离物比较直接用于在线数据库和跨实验室。虽然MLST仍然是许多细菌病原体的流行病学类型的黄金标准,但越来越多的研究发现MLVA8、9、10的歧视性能力明显较高。还公布了几种针对鱼类致病菌的规程,如弗朗西斯拉诺图尼西斯、爱德华西耶拉皮西达和雷尼巴西兰藻11、12、 13.
这里提出的十位MLVA协议,最近形成了广泛的Y.ruckeri种群研究14的基础,涉及从琼脂培养的菌落中提取DNA,多路PCR和毛细血管电泳(CE),其次是在silico应用程序中的下游。对于每个被检查的分离物,两个多路PCR,都含有五个荧光标记引物对(6FAM,NED或VIC),每个针对单个VNTR区域,在相同的条件下并行运行。通过凝胶电泳 (GE) 验证 PCR 放大器后,PCR 产物在 CE 分析之前被稀释,表示相应 VNTR 位点的峰是从生成的电检文件中调用的。与计算 CE 迁移模式中轻微、特定于序列差异的按位特定公式一起,使用 VNTR CE 大小调用来计算与 10 位 MLVA 配置文件串联的 VNTR 重复计数。这些用作动物学评估的输入(例如,通过最小生成树 (MST) 图中的聚类分析)。
这里介绍的两种多路多路PCR在模板DNA质量差的情况下显得相对稳健,但在使用DNA浓度极高的模板时,偶尔也会观察到PCR扩增的缺乏。这些问题通过在 PCR 之前稀释模板而很容易解决。也可以使用除此处采用的DNA提取方法外的其他脱氧核糖核酸(DNA提取方法),例如商业试剂盒。
尽管每个多倍 PCR 反应预期有 5 个倍数,但不应始终期望 GE 提供五个视觉可区分的频段,因为相同反应中的一些(不同标记的)VNTR 位点具有重叠的大小范围。如果需要,最终 PCR 延长时间可能会缩短 60 分钟,但可能导致后续 CE 电表中分裂峰的发生增加(见下文)。值得注意的是,由于 GE 步骤的目的纯粹是 PCR 放大器的定性验证,因此运行时间、电压和/或凝胶配方可以作为首选调整。如果 GE 观察到特别弱的带,则建议在 CE 之前降低这些样品的稀释系数。
虽然此处描述的 CE 协议运行在特定的商业毛细管电泳装置上(参见材料表),但不同的 CE 系统可能具有不同的样本要求,这反过来又会提示对协议进行一些修改.有关相应试剂/设备、校准等的说明,请参阅相应 CE 系统制造商的手册,以便进行片段分析。也有可能,在CE期间观察到的偏置放大子移动模式在CE系统和/或机器之间可能相对不同,正如之前在其他MLVA协议15、16中已经记载的那样。如果发生最终(四舍五入)VNTR重复计数受到影响的程度,这意味着用于确定VNTR重复计数的点点特定变量s和i(表1),必须重新校准。 这涉及到在比较精确序列大小和CE大小调用的绘图上的线性回归,如Gulla等人201814所述。
在尺寸调用期间,可在电图中观察到分裂峰和口吃峰,这两种基于 CE 的 MLVA 类型17中都有著名的人工制品。图4。虽然应忽略口吃峰,但在拆分峰值由单个基对分隔的情况下,应始终为下游应用选择较长的峰值。此外,表示缺少特定 VNTR 位点的缺失峰值很少见,但可能发生,在这种情况下,应分配重复计数”0″。如果提取DNA的起始培养物不纯(即包含多个Y. ruckeri子类型),则 CE 之后可以观察到多个对应于同一位点/位点的多个高峰。然后,必须在新的DNA提取之前从单个菌落进行二次培养,以便重新键入。
如协议所述,PCR的模板DNA默认情况下应从Y.ruckeri的纯培养物中提取。然而,在少数情况下,通过qPCR(Ct值<27)对Y.ruckeri检测呈阳性的卵液样品,在未事先培养的情况下,使用增加的基因组DNA(用商业试剂盒提取)作为模板,成功地直接进行了MLVA类型化。虽然这种方法没有经过广泛的测试或验证,但它确实表明这种MLVA测定的潜力,检查复杂的生物基质含有从一系列不同的生物体,除了Y.ruckeri的DNA。
这里介绍的整个MLVA打字程序,从DNA提取到动物动物学评估,可以在一个工作日内完成。然而,所检查的样本数量与DNA提取、PCR和CE所需的时间处于子线性关系,因此,当同时运行多个样本时,该方法的效率要高得多。然而,对于大多数基于实验室的方法来说,这是情况,并且作为Y.ruckeri的流行病学子分型工具,高分辨率、简单性和可移植性的结合使得这种MLVA测定优于先前公布的协议4 , 5.它也被用来验证Y.ruckeri血清14的有限流行病学相关性。
通过基于MLVA的综合种群研究,涉及从一系列时空起源和栖息地(宿主鱼类、环境等)中回收的484个Y.ruckeri分离物,我们对动物的表皮和种群的理解这种重要的鱼类病原体的结构大幅增加14。MLVA打字能够追踪几十年来人类传播的克隆,大概是通过运输鱼类,以及鉴定当地有限的菌株。此外,虽然细菌的某些克隆复合物显然可能与疾病,特别是鱼类宿主(虹鳟鱼和大西洋鲑鱼,分别)有关,但其他仅从环境来源和/或临床上未受影响的鱼类中恢复标本。因此,该方法的适用性不仅仅限于感染追踪,因为它还可能提供具有潜在相关性的信息,例如疫苗开发、风险评估和维护国家生物安全。它目前正积极在挪威兽医研究所使用,作为调查挪威水产养殖中Y.ruckeri诊断的工具。
The authors have nothing to disclose.
本研究由挪威海鲜研究基金FHF(项目号901119和901505)资助。我们想感谢在方法开发过程中使用的细菌分离物和样品的所有参与者。
22°C/15°C incubator | As preferred. | NA | |
5' Labeled Primer, 10K PMOL, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | 450007 | Sequences and labelling in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
Agarose, universal, peqGOLD | VWR | 732-2789P/732-2788 | Used during gel electrophoresis. |
Avant 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | A30469 | Used for capillary electrophoresis fragment analysis. |
BioNumerics7 modules | Applied Maths | NA | Used for generating Minimum spanning trees from MLVA data. |
Centrifuge(s) | As preferred. | NA | |
Custom DNA Oligo, 25N, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | A15612 | Sequences in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Loading dye used during gel electrophoresis. |
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Centrifuge tubes used during DNA extraction. |
Freezer | As preferred. | NA | |
Fume cupboard | As preferred. | NA | |
Gel electrophoresis system | As preferred. | NA | |
GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water | Biotium | 41003 | Fluorescent nucleic acid dye used during gel electrophoresis. |
GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | Used for reading electropherograms from capillary electrophoresis. |
GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use | Thermo Fisher Scientific | SM0373 | DNA ladder used during gel electrophoresis. |
GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | Size standard used during capillary electrophoresis. |
Heating block | As preferred. | NA | |
Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320/4440753 | Deionized formamide used during capillary electrophoresis. Prepare working aliquouts. |
Milli-Q water | NA | NA | Purified water used during PCR and capillary electrophoresis. Standard recipe; produced in-house. |
Multiplex PCR Plus Kit | Qiagen | 206151/206152 | |
PCR thermal cycler | As preferred. | NA | |
POP-7 Polymer for 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers | Thermo Fisher Scientific | A26077/4393713/4393709 | Separation matrix used during capillary electrophoresis. |
Pure culture Yersinia ruckeri | NA | NA | E.g. cryopreserved or fresh. |
RNase-free water | Qiagen | NA | In: Multiplex PCR Plus Kit |
Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
Trypsine soy agar/bovine blood agar | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
UV-based gel imaging/visualisation system | As preferred. | NA | |
Vortexer | As preferred. | NA |