Dissecação da Retina Pupal drosófila para imuno-histoquímica, análise ocidental e isolamento de RNA
Summary
Este trabalho apresenta um método cirúrgico para dissecando Drosophila pupal retina juntamente com protocolos para o processamento de tecido para extração de RNA, análise ocidental e imuno-histoquímica.
Abstract
A retina pupal Drosophila fornece um sistema de excelente modelo para o estudo de processos morfogenéticas durante o desenvolvimento. Neste trabalho, apresentamos um protocolo confiável para a dissecação da retina pupal Drosophila delicada. Nossa abordagem cirúrgica utiliza ferramentas prontamente disponíveis microdissection para abrir pupas e extrair precisamente complexos de olho-cérebro. Estas podem ser fixas, submetidas a imuno-histoquímica e retinas então montadas em corrediças do microscópio e fotografadas se o objetivo é detectar estruturas celulares ou subcelulares. Alternativamente, as retinas não fixadas podem ser isoladas do tecido cerebral, lysed em buffers apropriadas e utilizadas para proteína gel de electroforese ou mRNA extração (avaliar a expressão de proteínas ou gene, respectivamente). Paciência e prática significativa podem ser necessária para dominar o microdissection protocolo descrito, mas uma vez dominado, o protocolo permite isolamento relativamente rápido da retina principalmente sem danos.
Introduction
A retina de Drosophila é composta de aproximadamente 750 omatídeos, rodeados por células de pigmento, dispostas em um favo de mel lattice1,2,3,4. Cada omatídeo contém oito neurônios fotoreceptor, quatro células cone secretoras de lente e duas células primárias de pigmento. Ao redor cada omatídeo são células produtoras de pigmento do retículo e grupos de cerdas sensoriais. Devido à sua natureza pós mitótica e estereotipado arranjo hexagonal, Drosophila pupal retina fornece um sistema de excelente modelo para o estudo de processos morfogenéticas incluindo célula adesão5,6, 7,8,9,10 e apoptose11,12,13,14,15.
Vários protocolos publicados utilizam pressão de ar para extrair complexos de olho-cérebro de Drosophila pupas16,17,18. O protocolo descrito aqui, em vez disso utiliza ferramentas microdissection para cuidadosamente e isolar precisamente complexos de olho-cérebro, com o objetivo de se obter o tecido da retina intacto. Isso é fundamental se as retinas são para ser utilizada para morfológica, proteína, ou expressão gênica analisa desde danos à retina podem resultar em estresse celular ou morte, que poderia modificar a expressão celular do fenótipo ou gene. Além disso, depois do treino, complexos de 6 a 10 olho-cérebro podem ser isolados em 10 a 15 min, facilitando o objetivo de minimizar a variabilidade na idade e grau de desenvolvimento do tecido do olho dissecado.
A fixação, imunocoloração e montagem em todo o protocolo descrito abaixo é adequado para a preparação dos olhos de drosófila para microscopia fluorescente. As retinas podem ser incubadas com anticorpos alvejando proteínas de interesse. Por exemplo, anticorpos para componentes de junção aderente podem ser utilizados para visualizar as circunferências apicais das células para que características, incluindo o tipo de célula, forma e arranjo podem ser avaliados19. Antes da fixação, olhos em vez disso podem ser clivados do cérebro com a finalidade de extração de proteínas para análise ocidental, ou RNA para uso em qRT-PCR ou a sequenciação do ARN.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método de dissecação de olho pupal drosófila descrito aqui permite o isolamento de 6 a 10 complexos de olho-cérebro dentro de 10 a 15 min. No entanto, paciência e prática são essenciais para dominar a técnica de dissecação e melhorar a qualidade e a velocidade de dissecações. Desta vez de dissecação curto garante que cada olho é aproximadamente mesmo fase de desenvolvimento, reduzindo a variabilidade na expressão do fenótipo ou gene de retina em um conjunto de dados. Enquanto protocolos alter…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Zack tambor e nossos revisores para comentários úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela R15GM114729.
Materials
| Adobe Photoshop | Adobe | Image processing software | |
| Bamboo splints, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
| Beta mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Beta-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| Black dissecting dish | Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize. | ||
| Blade holder | Fine Science Tools | 10053 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693132001 | |
| Confocal microscope (Zeiss LSM 501) | Carl Zeiss | or similar microscope | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| Double-sided tape | 3M | 665 | |
| Drosophila food media, nutrient-rich | 7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20 | ||
| Drosophila food media, standard | Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fixative solution | 4% formadehyde in PBS, pH 7.4. | ||
| Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Forceps should be sharpened frequently. |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Glass 9-well dishes | Corning | 7220-85 | Also known as 9-well dishes |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| Glass petri dish | Corning | 3160-100BO | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Image Studio software version 5.2.5 | LI-COR Biosciences | Image processing software for quantitation of Western blots. | |
| Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer's instructions. |
| Lane marker reducing sample buffer | ThermoFisher Scientific | 39000 | 5X concentrated protein sample buffer. |
| Microcentrigure tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Microdissection scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Microwell trays (72 x 10 µL wells) | Nunc | 438733 | |
| Mounting media | 0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS | ||
| N-propylgallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4) | Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4°C | ||
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Sigma-Aldrich | P5368 | Prepare according to manufacturer's instructions |
| PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors) | 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4. | ||
| PBT | 0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4 | ||
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Primary antibody: goat anti-GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1 | Cell signaling | 9578S | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCAD2 | For immunofluorescence. Used at 1:20 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100. |
| RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit | Promega | Z6110 | |
| Rnase decontamination reagent (RNase Away) | Molecular BioProducts | 7002 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10050 | Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder. |
| Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | For immunofluorescence. Used at 1:200 |
| Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Cell Signaling Technology | 7077 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 305-035-003 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 215309 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 50860 | |
| Spectrophotometer (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c | |
| Stereo dissecting microscope (M60 or M80) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Sylgard (black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Sylgard (transparent) | Dow Corning | SYLG184 | Color black with finely ground charcol powder |
| Tissue: Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trizma hydrochloride pH7.5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Tungsten needle, fine | Fine Science Tools | 10130-10 | Insert into pin holder |
| Tungsten needle, sturdy | Fine Science Tools | 10130-20 | Insert into pin holder |
| WTLB (western tissue lysis buffer) | 150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution. | ||
| Yeast paste | (local supermarket) | Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O |
Referências
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