Dissektion der Drosophila Pupal Netzhaut Immunohistochemistry, westlichen Analyse und RNA-Isolation
Summary
Dieses Papier stellt eine Operationsmethode für sezieren Drosophila pupal Netzhaut zusammen mit Protokolle für die Verarbeitung von Gewebe für Immunohistochemistry, westlichen Analyse und RNA-Extraktion.
Abstract
Die Drosophila pupal Netzhaut bietet ein hervorragendes Modellsystem für das Studium der morphogenetischen Prozesse während der Entwicklung. In diesem Beitrag präsentieren wir Ihnen ein zuverlässiges Protokoll für die Zerlegung der zarten Drosophila pupal Netzhaut. Unsere chirurgische Ansatz nutzt verfügbar Mikrodissektion Werkzeuge um Puppen zu öffnen und extrahieren Sie genau Auge-Gehirn-komplexe. Diese feste, Immunohistochemistry und Netzhaut ausgesetzt dann montiert auf Objektträger und abgebildet, wenn das Ziel, zelluläre und subzelluläre Strukturen zu erkennen. Alternativ können Sie fixierten Netzhaut von Gehirngewebe isoliert, in entsprechende Puffer lysiert und für Gel-Elektrophorese oder mRNA Proteingewinnung (, Protein oder gen-Expression, bzw. bewerten) genutzt. Bedeutende Übung und Geduld können erforderlich sein, das beschriebenen Mikrodissektion Protokoll beherrschen, aber einmal gemeistert, das Protokoll ermöglicht relativ schnelle Isolation vor allem unbeschädigt Netzhaut.
Introduction
Die Drosophila Netzhaut besteht aus ca. 750 Ommatidien umgeben von Pigmentzellen in einer Bienenwabe Gitter1,2,3,4angeordnet. Jedes Ommatidium enthält acht Photorezeptor Neuronen, vier Objektiv-sezernierenden Zapfen und zwei primäre Pigmentzellen. Rund um jedes Ommatidium sind pigmentbildenden Gitter Zellen und sensorischen Borsten Gruppen. Aufgrund seiner Post-mitotische Natur und Stereotype hexagonalen Anordnung bietet die Drosophila pupal Netzhaut eine hervorragendes Modell-System für das Studium der morphogenetischen Prozesse einschließlich Zelle Adhäsion5,6, 7,8,9,10 und Apoptose11,12,13,14,15.
Mehrere veröffentlichte Protokolle nutzen Luftdruck, Auge-Gehirn-komplexe von Drosophila Puppen16,17,18zu extrahieren. Das Protokoll beschrieben hier stattdessen nutzt Mikrodissektion Werkzeuge, um sorgfältig und genau Auge-Gehirn-komplexe mit dem Ziel der Erlangung unbeschädigt Netzhautgewebe zu isolieren. Dies ist entscheidend, wenn die Netzhaut für genutzt werden morphologische, Protein und Genexpression analysiert, da Schäden an der Netzhaut führen kann, in zellulären Stresses oder Tod, der die zellulären Phänotyp oder gen-Ausdruck ändern könnte. Darüber hinaus können nach dem Training, 6 bis 10-Auge-Gehirn-komplexe in 10 bis 15 min, erleichtern das Ziel der Minimierung Variabilität in den Alter und Entwicklungsstadium der seziert Augengewebe isoliert werden.
Die Fixierung, Immunostaining und vollständig-hängen Protokoll beschrieben ist geeignet für die Zubereitung von Drosophila Augen für Fluoreszenz-Mikroskopie. Netzhaut können mit Antikörpern interessierender Proteine gezielt inkubiert werden. Zum Beispiel können Antikörper gegen Adherens Junction Komponenten genutzt werden, um die apikale Umfänge von Zellen zu visualisieren, so dass Eigenschaften einschließlich Zelle Art, Form und Anordnung bewerteten19sein können. Vor der Fixierung können Augen stattdessen aus dem Gehirn zum Zweck der Gewinnung von Protein für die westlichen Analyse oder RNA für den Einsatz in qRT-PCR oder RNA-Sequenzierung abgespalten werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Methode der Drosophila pupal Auge Dissektion hier beschriebenen ermöglicht für die Isolierung von 6 bis 10-Auge-Gehirn-komplexe innerhalb von 10 bis 15 Minuten. Geduld und Übung sind jedoch notwendig, um die Dissektion Technik beherrschen und Verbesserung der Qualität und Geschwindigkeit der Sektionen. Diesmal kurz Dissektion sorgt dafür, dass jedes Auge ungefähr gleichen Entwicklungsstadium, Reduzierung der Variabilität in der Phänotyp oder gen Ausdruck der Netzhaut in einem Dataset. Während altern…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Zack Trommel und unsere Rezensenten für hilfreiche Kommentare auf das Manuskript. Diese Arbeit wurde durch R15GM114729 unterstützt.
Materials
| Adobe Photoshop | Adobe | Image processing software | |
| Bamboo splints, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
| Beta mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Beta-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| Black dissecting dish | Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize. | ||
| Blade holder | Fine Science Tools | 10053 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693132001 | |
| Confocal microscope (Zeiss LSM 501) | Carl Zeiss | or similar microscope | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| Double-sided tape | 3M | 665 | |
| Drosophila food media, nutrient-rich | 7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20 | ||
| Drosophila food media, standard | Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fixative solution | 4% formadehyde in PBS, pH 7.4. | ||
| Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Forceps should be sharpened frequently. |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Glass 9-well dishes | Corning | 7220-85 | Also known as 9-well dishes |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| Glass petri dish | Corning | 3160-100BO | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Image Studio software version 5.2.5 | LI-COR Biosciences | Image processing software for quantitation of Western blots. | |
| Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer's instructions. |
| Lane marker reducing sample buffer | ThermoFisher Scientific | 39000 | 5X concentrated protein sample buffer. |
| Microcentrigure tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Microdissection scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Microwell trays (72 x 10 µL wells) | Nunc | 438733 | |
| Mounting media | 0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS | ||
| N-propylgallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4) | Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4°C | ||
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Sigma-Aldrich | P5368 | Prepare according to manufacturer's instructions |
| PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors) | 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4. | ||
| PBT | 0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4 | ||
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Primary antibody: goat anti-GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1 | Cell signaling | 9578S | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCAD2 | For immunofluorescence. Used at 1:20 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100. |
| RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit | Promega | Z6110 | |
| Rnase decontamination reagent (RNase Away) | Molecular BioProducts | 7002 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10050 | Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder. |
| Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | For immunofluorescence. Used at 1:200 |
| Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Cell Signaling Technology | 7077 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 305-035-003 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 215309 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 50860 | |
| Spectrophotometer (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c | |
| Stereo dissecting microscope (M60 or M80) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Sylgard (black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Sylgard (transparent) | Dow Corning | SYLG184 | Color black with finely ground charcol powder |
| Tissue: Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trizma hydrochloride pH7.5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Tungsten needle, fine | Fine Science Tools | 10130-10 | Insert into pin holder |
| Tungsten needle, sturdy | Fine Science Tools | 10130-20 | Insert into pin holder |
| WTLB (western tissue lysis buffer) | 150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution. | ||
| Yeast paste | (local supermarket) | Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O |
Referências
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