Summary

游泳诱导麻痹对线虫多巴胺信号的评价

Published: April 03, 2019
doi:

Summary

游泳诱导麻痹 (SWIP) 是一种成熟的行为检测方法, 用于研究线虫中多巴胺信号的潜在机制.然而, 缺乏一个详细的方法来执行该检测。在这里, 我们描述了 SWIP 的分步协议。

Abstract

该方案中描述的游泳检测方法是识别调节多巴胺能突触的蛋白质的有效工具。与哺乳动物类似, 多巴胺 (DA) 控制着线虫的多种功能, 包括学习和运动活动。刺激 DA 释放 (例如, 安非他明 (AMPH) 处理) 或阻止 DA 清除的条件 (例如, 缺乏 DA 转运体 (dat-1)的动物无法将 da 重新积累到神经元中) 会产生过量的细胞外 da最终导致抑制运动。当动物在水中游泳时, 这种行为尤其明显。事实上, 虽然野生类型的动物继续游泳很长一段时间, dat-1空突变体和野生类型处理的 amph 或 da 转运体抑制剂下沉到井底, 不移动。这种行为被称为 “游泳诱发麻痹” (SWIP)。虽然 SWIP 检测已经建立, 但缺乏对该方法的详细描述。在这里, 我们介绍了执行 SWIP 的分步指南。为了进行检测, 将幼虫后期阶段-4 动物放置在含有控制蔗糖溶液的玻璃光板中, 无论是否有 AMPH。动物的游泳行为得分, 或者通过立体镜下的可视化, 或者通过使用安装在立体镜上的相机自动录制。然后使用跟踪软件对视频进行分析, 该软件以热图的形式直观地表示了撞击频率和瘫痪。手动和自动化系统都保证了动物游泳能力的容易量化读数, 从而便于筛选多巴胺能系统内带有突变的动物或辅助基因。此外, 社会福利和儿童保护方案可用于阐明 AMPH 等滥用药物的行动机制。

Introduction

动物执行各种先天和复杂的行为, 这些行为由复杂的信号转导过程协调的不同神经递质介导。神经递质多巴胺 (DA) 介导不同物种高度保守的行为, 包括学习、运动功能和奖励处理。

土壤线虫的神经系统相对简单, 只有302个神经元, 表现出明显复杂的行为, 包括许多由 da 调节的行为, 如交配、学习、觅食、运动和产蛋1. 除其他特点外, 寿命周期短、处理方便和信号分子的守恒, 突出了使用线虫作为研究保守行为的神经基础的模型的优势。

雌雄同体线虫含有8个多巴胺能神经元;除此之外, 雄性还为交配目的多了六个对。与哺乳动物一样, 这些神经元合成 DA 并表达 da 转运体 (DAT-1), 这是一种单不在多巴胺能神经元中的膜蛋白, 它将突触裂隙中释放的 DA 转运回多巴胺能神经元。此外, 在 DDA 的合成、包装和释放的每一步中, 大多数蛋白质都是高度保守的, 在蠕虫和人类之间, 与哺乳动物一样, da 调节线虫2 中的喂养行为和运动。

线虫在固体表面上爬行, 并在水中游泳, 具有特有的撞击行为。有趣的是, 缺乏 dat-1 (dat-1) 表情的突变体在固体表面上正常爬行, 但在水中浸泡时无法维持游泳。这种行为被称为游泳引起的麻痹, 或 SWIP。先前的实验表明, SWIP 在一定程度上是由突触裂隙中的 DA 过多引起的, 最终过度刺激 D2 样突触后受体 (DOP-3)。虽然最初是在dat-1型淘汰赛动物 3中发现的, 但在使用阻止 dat 活性的药物 (例如, imipamine4) 和/或诱导 da 释放 (例如苯丙胺5) 的药物治疗的野生类型动物中也观察到了 swip。另一方面, 避免 da 的合成和释放以及阻断 DOP-3 受体功能的药理或遗传操作可以防止 SWIP6。总之, 这些已经公布的数据已经确定了 swip 作为一个可靠的工具, 研究突变蛋白在多巴胺能突触 3,4,7和用于前基因屏幕, 用于识别涉及 da 信号789101112 的新调控途径。此外, 通过提供药物诱导的活体动物行为的易于量化的读数, swip 可以阐明药物 (如安非他明 (AMPH) 和偶酮类药物在多巴胺能突触5的作用机制,6,13,14,15岁

执行 SWIP 检测的协议已在16之前描述过。在这里, 我们详细介绍了执行检测的方法和设置, 目的是为线虫社区提供一个视觉指南, 以有效地执行 swip。

Protocol

1. 解决方案和媒体的准备 在1升蒸压去离子水中溶解 kh 2 po 4 3.0 g (22.05 mm)、na 2 hpo4 6.0 g (42.2 mm) 和 nacl 5.0 g (85.5 mm) 制备 mM 缓冲液.高压灭菌后加入 1 M MgSO4 1.0 ml (1 毫升, 最终体积为100毫升蒸压去离子水)。将产生的 10x ML 的100毫升与蒸压去离子水的900毫升混合, 制成1x 溶液。 要做鸡蛋缓冲液, 溶解6.896 克氯化钠 (118 mM), 3.5 78 克 KCl (48 mM), 0.294 克 Cc…

Representative Results

我们提供了一个由 AMPH 治疗诱导的 SWIP 检测的例子。图 1显示了上述检测设置的示意图。对于手动检测, 约8-10 同步的后期 L4 级蠕虫收集睫毛或铂素拾取, 并放置在玻璃光斑板中, 其中装有40μl 的 200 MOMSML 蔗糖 (控制溶液) 或蔗糖, 并进行了甜甜量测试。 当动物停止游泳 (即, 表现出 SWIP) 时, 它们会迅速沉入?…

Discussion

在这里, 我们描述了一个分步的协议, 以执行行为分析, swip, 在c. elegans。这个协议简单而直接, 没有重大的技术障碍, 使这种检测非常方便用户。然而, 为了有效地进行检测, 还需要考虑一些关键的方面。

应注意确保用于检测的蠕虫吃得很好, 因为饮食限制会影响 SWIP17。在采摘过程中对蠕虫进行温和处理, 以及在裂解过程中及时处理次氯酸钠/naoh 治疗是关…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

作者要感谢兰迪·布莱克利博士实验室的 Osama Refai 博士对 SWIP 的自动化分析提供的指导。这项工作得到了国家卫生研究院 R01 DA042156 到 LC 的资助。

Materials

Aluminum foil Reynolds wrap 1091835
Amphetamine Sigma 51-63-8  
Autoclave
Bacterial Incubator New Brunswick scientific M1352-0000
Bacteriological grade, Agar Lab Scientific, Inc  A466
Bacto (TM) Peptone BD REF 211677
Calcium Chloride (dihydrate) Sigma-Aldrich C3881
Camera  Thorlabs U-CMAD3
Centrifuge  Eppendorf 5810R 15amp E215059
Cholesterol Sigma-Aldrich 57-88-5
Deionised water Millipore Z00QSV0WW Milli-Q
Depression glass spot plate Corning Corning, Inc. 722085
Erlenmeyer flask ThermoFisher 4103-0250PK
Eye lash
Glass slide Fisherbrand 12-550-15
Graphing and statistical software Prism Graphpad 5
HEPES Sigma-Aldrich RB=H3375 & H7006
Hypochlorite Hawkins Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal
LB Broth, Miller Fisher BP1426
Magnesium Chloride (Hexahydrate) Sigma-Aldrich RB=M0250 500g
Magnesium sulfate (heptahydrate) Sigma-Aldrich M1880
Magnetic stir bar Fisherbrand 16-800-510 
Microcentrifuge tubes ThermoFisher 69715
NA 22 bacteria CGC
Nystatin Sigma 1400-61-9
Osmometer Advanced Instruments, Inc Model 3320
Pasteur Pipettes Fisherbrand 13-678-20A
Petriplates Falcon 351007
pH Meter Orion VersaStar Pro IS-68X591202-B 0514
Polystrine conical tubes Falcon 352095
Potassium Chloride Sigma-Aldrich  P9541
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich 7778-77-0
Potassium Phosphate – DIBASIC Sigma-Aldrich P-8281
Potassium Phosphate – MONOBASIC Sigma-Aldrich P0662
Serological pipettes VWR 10ml=89130-898
Shaker Reliable Scientific 55S 12×16
Sodium Chloride Fisher RB=BP358-1
Sodium dihydrogen Phosphate Fisher RB=S381
Spreadsheet MS office Microsoft Excel
Stereo Microscope Zeiss Model tlb3. 1 stemi2000
Sterile Pipette tips Various 02-707-400
Sucrose Sigma-Aldrich RB=S5016
Superglue Loctite 1647358 .14 oz.
SwimR sofware 10.18129/B9.bioc.SwimR
Tracker 2 Worm Tracker 2.0 www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/
Video recording software Virtualdub http://www.virtualdub.org/

Referências

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Citar este artigo
Kudumala, S., Sossi, S., Carvelli, L. Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (146), e59243, doi:10.3791/59243 (2019).

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