Natación parálisis inducida a evaluar dopamina señalización en Caenorhabditis elegans
Summary
Natación por parálisis (SWIP) es un ensayo de comportamiento bien establecido utilizado para estudiar los mecanismos subyacentes de la dopamina en Caenorhabditis elegans (C. elegans). Sin embargo, carece de un método detallado para llevar a cabo el ensayo. Aquí, describimos un protocolo paso a paso para SWIP.
Abstract
El ensayo de natación se describe en este protocolo es una herramienta válida para identificar proteínas regulan el dopaminérgico sinapsis. Similar a los mamíferos, dopamina (DA) controla varias funciones en C. elegans como actividad de aprendizaje y motor. Condiciones que estimulan la liberación de DA (p. ej., tratamientos de anfetamina (AMPH)) o que evitar separación de DA (por ejemplo, animales que carecen del transportador de DA (dat-1) que son incapaces de reaccumulating DA en las neuronas) generan un exceso de DA extracelular en última instancia dando por resultado locomoción inhibido. Este comportamiento es particularmente evidente cuando los animales nadan en el agua. De hecho, mientras animales de tipo silvestre a nadar durante un largo período, mutantes nulos dat-1 y tipo salvaje trataron con AMPH o inhibidores del transportador de DA se hunden hasta el fondo del pozo y no se mueven. Este comportamiento se denomina “Parálisis inducida de natación” (SWIP). Aunque está bien establecido el ensayo SWIP, carece de una descripción detallada del método. Aquí, describimos una guía paso a paso para realizar SWIP. Para realizar el ensayo, último larvales etapa 4 animales se colocan en una placa de punto de cristal que contiene control de solución de sacarosa con o sin AMPH. Animales son marcados por su comportamiento de natación ya sea manualmente por visualización bajo un estereoscopio o automáticamente por la grabación con una cámara montada en el estereoscopio. Videos entonces se analizan utilizando un software de seguimiento, que produce una representación visual de frecuencia de golpear y de parálisis en forma de mapas de calor. Los sistemas manuales y automatizados garantizan una lectura fácilmente cuantificable de la capacidad de natación de los animales y facilitan así la detección de animales con mutaciones en el sistema dopaminérgico o para genes auxiliares. Además, SWIP puede utilizarse para aclarar el mecanismo de acción de drogas de abuso como AMPH.
Introduction
Los animales realizan una variedad de comportamientos innatos y complejas que están mediadas por diferentes neurotransmisores coordinados por intrincados procesos de señalización. El neurotransmisor dopamina (DA) media comportamientos altamente conservados entre especies, incluyendo el aprendizaje, la función motora y procesamiento de la recompensa.
C. elegans, los nematodos del suelo con un sistema nervioso relativamente simple y bien asignado, que consta de sólo 302 neuronas, muestra comportamientos notablemente complejos, incluyendo muchos que son reguladas por DA como acoplamiento, aprendizaje, alimentación, locomoción y puesta de huevos 1. entre otras características, ciclo de vida corto, facilidad de manejo y la conservación de moléculas señalizadoras, destacar las ventajas del uso de C. elegans como modelo para estudiar la base neural de conductas conservadas.
El hermafrodita C. elegans contiene ocho neuronas dopaminérgicas; Además de éstos, el hombre contiene seis pares extras para fines de apareamiento. Como en mamíferos, estas neuronas sintetizan DA y expresan el DA transportador (DAT-1), una proteína de membrana que se encuentra exclusivamente en las neuronas dopaminérgicas, que transporta DA liberada en la hendidura sináptica en las neuronas dopaminérgicas. Además, la mayoría de las proteínas implicadas en cada paso de la síntesis, empaque y liberación de DA está muy conservada entre los gusanos y los seres humanos y, como en los mamíferos DA modula la alimentación comportamientos y locomoción en C. elegans2.
C. elegans se arrastra en las superficies sólidas y nada con un comportamiento característico de golpear en el agua. Curiosamente, mutantes que carecen de expresión del DAT-1 (dat-1) gatear normalmente sobre una superficie sólida pero incapaces de sostener la natación cuando sumergido en el agua. Este comportamiento se denomina natación inducida por parálisis o SWIP. Experimentos anteriores demostraron que SWIP, en parte, es causada por un exceso de DA en la hendidura sináptica que en última instancia estimula los receptores postsinápticos D2-like (DOP-3). Aunque originalmente identificado en el dat-1 nocaut animales3, SWIP también se observa en animales de tipo silvestre tratados con fármacos que bloquean la actividad de DAT (p. ej., imipramina4) o inducir la liberación de DA (p. ej., anfetamina,5). Por otro lado, manipulaciones farmacológicas o genéticas evitando la síntesis y liberación de DA y el bloqueo de función de receptor DOP-3 previenen SWIP6. Tomados en conjunto, estos datos ya publicados han establecido SWIP como herramienta fiable para estudiar los efectos conductuales causados por las proteínas mutadas en dopaminérgicos sinapsis3,4,7 y ser empleado para adelante pantallas genéticas para la identificación de nuevos vías reguladoras implicadas en DA señalización7,8,9,10,11,12. Además, al proporcionar una lectura fácilmente cuantificable del comportamiento droga-inducida en animales vivos, SWIP permite la elucidación de mecanismos de acción de drogas como la anfetamina (AMPH) y azaperone en el dopaminérgico sinapsis5, 6 , 13 , 14 , 15.
Se han descrito protocolos para realizar los ensayos SWIP antes16. Aquí, describimos en detalle la metodología y la instalación para realizar el ensayo con el objetivo de proporcionar a una guía visual para la comunidad de C. elegans para efectivamente realizar SWIP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, describimos un protocolo paso a paso para realizar un ensayo conductual, SWIP, en C. elegans. Este protocolo es sencillo con no vallas técnicas principales hacer este usuario de ensayo muy amigable. Sin embargo, existen algunos aspectos críticos que deben considerarse para efectivamente llevar a cabo el ensayo.
Debe tenerse cuidado para asegurar que los gusanos que se utiliza para el análisis son bien alimentados, ya que afecta la restricción dietética SWIP<sup class="xref…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer el Dr. Osama Refai del laboratorio del Dr. Randy Blakely de orientación con el análisis automatizado de SWIP. Este trabajo fue apoyado por fondos del NIH R01 DA042156 LC.
Materials
| Aluminum foil | Reynolds wrap | 1091835 | |
| Amphetamine | Sigma | 51-63-8 | |
| Autoclave | |||
| Bacterial Incubator | New Brunswick scientific | M1352-0000 | |
| Bacteriological grade, Agar | Lab Scientific, Inc | A466 | |
| Bacto (TM) Peptone | BD | REF 211677 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Thorlabs | U-CMAD3 | |
| Centrifuge | Eppendorf 5810R 15amp | E215059 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | |
| Deionised water | Millipore | Z00QSV0WW | Milli-Q |
| Depression glass spot plate | Corning | Corning, Inc. 722085 | |
| Erlenmeyer flask | ThermoFisher | 4103-0250PK | |
| Eye lash | |||
| Glass slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Graphing and statistical software | Prism | Graphpad 5 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | RB=H3375 & H7006 | |
| Hypochlorite | Hawkins | Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal | |
| LB Broth, Miller | Fisher | BP1426 | |
| Magnesium Chloride (Hexahydrate) | Sigma-Aldrich | RB=M0250 | 500g |
| Magnesium sulfate (heptahydrate) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| Magnetic stir bar | Fisherbrand | 16-800-510 | |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| NA 22 bacteria | CGC | ||
| Nystatin | Sigma | 1400-61-9 | |
| Osmometer | Advanced Instruments, Inc | Model 3320 | |
| Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Petriplates | Falcon | 351007 | |
| pH Meter | Orion VersaStar Pro | IS-68X591202-B 0514 | |
| Polystrine conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Potassium Phosphate – DIBASIC | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| Potassium Phosphate – MONOBASIC | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Serological pipettes | VWR | 10ml=89130-898 | |
| Shaker | Reliable Scientific | 55S 12×16 | |
| Sodium Chloride | Fisher | RB=BP358-1 | |
| Sodium dihydrogen Phosphate | Fisher | RB=S381 | |
| Spreadsheet | MS office | Microsoft Excel | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model tlb3. 1 stemi2000 | |
| Sterile Pipette tips | Various | 02-707-400 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | RB=S5016 | |
| Superglue | Loctite | 1647358 .14 oz. | |
| SwimR sofware | 10.18129/B9.bioc.SwimR | ||
| Tracker 2 | Worm Tracker 2.0 | www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ | |
| Video recording software | Virtualdub | http://www.virtualdub.org/ |
Referências
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