여기, 우리 CRISPR-Cas9-대상 활동의 손실 없이 더 높은 특이성을 달성 하기 위해 최적화 하는 프로토콜을 제시. 우리는 원하는 특성을 가진 돌연변이 Cas9를 찾을 수 라고 스나이퍼-화면 감독된 진화 접근을 사용 합니다. 스나이퍼-Cas9와 잘린된 단일 가이드 RNAs는 ribonucleoprotein 형태로 배달 높은 특이성을 달성 하기 위한 잘 알려진 전략 이다.
클러스터 된 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR)의 개발-관련된 단백질 9 (Cas9) 치료 modalities에 요구는 잠재적으로 해로운 오프 대상 효과의 회피. 이러한 효과 줄이기 위해 여러 가지 방법은 고안 되었습니다. 여기, 우리는 대장균을 제시-기반의 지시 진화 방법 스나이퍼-화면으로 최적화 된 Cas9 variant를 불리고 스나이퍼-Cas9 라는 대상에 활동을 유지. 스나이퍼-화면을 사용 하 여, 긍정적이 고 부정적인 선택을 수행할 수 있습니다 동시에. 화면도 다른 단일 가이드 RNA (sgRNA) 시퀀스 진정한 긍정적인 안타에 대 한 풍부 하 게 반복할 수 있습니다. Cas9 변종 표현 하 CMV PltetO1 듀얼 모터를 사용 하 여 풀링된 라이브러리의 성능은 포유류 세포에 신속 하 게 확인할 수 있습니다. 또한 스나이퍼-Cas9의 특이성을 증가 하는 방법은 설명 합니다. 첫째, 잘린된 sgRNAs 사용 하 여 이전 Cas9 특이성을 증가 표시 되었습니다. 다른 조작된 Cas9s와 달리 스나이퍼 Cas9 잘린된 sgRNAs와 결합 될 때에 대상 활동의 야생-타입 (WT) 수준을 유지 합니다. 둘째, 플라스 미드 형식 대신 ribonucleoprotein (RNP) 형태로 스나이퍼-Cas9의 배달 대상에 활동을 영향을 주지 않고 가능 하다.
이 문서에서 우리는 다른 전략을 결합 하 여 Cas9의 특이성을 개선 하고자 합니다. CRISPR-Cas9의 대상 오프 효과 피하고 다양 한 방법 들이 개발 되었습니다. 예를 들어 잘린된 sgRNAs 높은 특이성1을 달성 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, Cas9 배달 방법 높은 특이성2를 RNP 형식 플라스 미드 형식에서 변경할 수 있습니다. 연쇄 상 구 균 pyogenes Cas9의 특정 아미노산 잔류물 (SpCas9) 단백질에 따라 합리적인 수정 된 디자인3,,45설명한. 또한, 아미노산 잔류물 무작위 방식으로 변경 되었습니다 및 높은 특이성으로 Cas9 변종 대장균7,8 시스템 심사 또는 효 모6 을 사용 하 여 발견 했다.
그러나, 많은 그룹 보고 Cas9 변형 수 Cas9와 기판 전시 낮은 대상에 활동7,,89, 사이 일반적인 상호 작용을 디자인을 사용 하 여 설계 10 , 11 , 12. 우리는 대장균을 개발-감독된 진화 시스템, 스나이퍼-화면, 임의로 mutagenized Cas9 이체 화면을 기반으로. 시스템 심사는 E. 콜라이 대장균의 빠른 배로 시간과 더 높은 변환 효율성 때문에 효 모 시스템 장점이 있습니다.
부정적이 고 긍정적인 선택, 3 개의 다른 플라스 미드와 관심 (GOI)의 유전자를 대장균 게놈으로 통합에 따라 스나이퍼-화면에 사용 됩니다. Cas9 변종 대장균 에서 확인 된 후보자 subcloning 필요 없이 포유류 세포에서 테스트할 수 있도록 낮은 복사 번호 플라스 미드의 CMV PltetO1 듀얼 모터 시스템 아래 표시 됩니다. GOI Tn7 transposon 시스템을 사용 하 여 대장균 게놈으로 소개 된다. SgRNA 플라스 미드 복제의 온도 민감한 출처를 포함 하는 sgRNA GOI;을 대상으로 표현 그러나, sgRNA 및 GOI 시퀀스는 완벽 하 게 일치 되지. 완벽 하 게 일치 sgRNA 대상 사이트는 치명적인 제품 gyrase 독극물을 인코딩하는 ccdB 유전자를 포함 하는 세 번째 플라스 미드에 존재 합니다. 이 시스템에서 높은 오프 대상 활동 Cas9 이체를 표현 하는 세포 두 배 물가 틈 (DSBs)는 genomic DNA에 있는 일치 하지 않는 사이트에 도입 하기 때문에 제거 됩니다. 다른 한편으로, Cas9 변종 낮은 대상에 활동을 표현 하는 세포도 치명적인 ccdB 유전자 발현 때문에 제거 됩니다. Cas9 변종 식 수준 선택 힘을 조정 하는 anhydrotetracycline (ATC)의 농도 변경 하 여 변경할 수 있습니다.
우리는 그 시스템의 감도 증가 시킬 것입니다 보다는 플라스 미드는 genomic DNA에 일치 하지 않는 sgRNA 대상 사이트를 찾는 것을 권유. 이 방법의 장점은 하나의 게놈 사이트는 반면 각각 단일 내에서 대상 사이트를 포함 하는 많은 플라스 미드는 대장균 세포.
이 시스템을 사용 하 여, 우리는 Cas9 변종, 스나이퍼-Cas9, WT-대상에 활동을 표시 하 고 대상 오프 활동 WT Cas9에 비해 감소 확인. 스나이퍼-Cas9 잘린된 sgRNAs 또는 RNP 기반 배달 보다는 배달 플라스 미드-기반을 사용 하 여 더 높은 특이성 비율을 달성할 수 있다.
스나이퍼-Cas9 단백질 및 인코딩 플라스 미드 스나이퍼-Cas9를 성가신 심사 절차를 피하려고 하는 사람들을 위해 사용할 수 있습니다. 높은 특이성 비율을 제공 하는 결정 한다 sgRNA의 최적의 길이 사용 하 여 이러한 자료. 또한, 스나이퍼-Cas9 및 sgRNA RNP 형태로 발생 하기 때문에 그것은 일반적으로 플라스 미드 형태로 배달 보다는 더 높은 특이성 비율에 좋습니다. 스나이퍼-Cas9, 달리 다른 조작된 Cas9 변종 잘린된 sgRNAs6,7 또는 예외 (고음질-Cas9) RNP 양식8 에서 배달와 호환 되지 않습니다.
스나이퍼-화면, 일치 하지 않는 시퀀스의 선택 가장 중요 한 단계입니다. GOI 시퀀스 향해 낮은 분열 활동에 연관 된 일치 하지 않는 sgRNA의 선택은 피해 야 한다. 그렇지 않다면, 특이성의 WT 수준 Cas9 변종 대장균 게놈 DNA 일치 하지 않는 대상 사이트를 쪼개 하지 것입니다. 이 효과 심사 절차 전체를 위태롭게 하는 배경 식민지의 많은 수에서 발생 합니다.
E. 콜라이 있기 때문에 빠른 시간 및 효 모, 스나이퍼-화면에 비해 높은 변환 효율을 두 배로 유리에 비해 효 모 기반 심사 방법. 또한, 스나이퍼 화면 다른 대장균보다 더 민감한 해야-는 플라스 미드에 일치 하지 않는 사이트를 수행 하는 시스템을 기반으로: genomic DNA의 1 개의 사본 및 따라서 단 하나 우리의 시스템에 많은 수의 일치 하지 않는 사이트의 복사본 플라스 미드는 단일 내에서 대장균 세포.
DSBs, Cpf1s, SaCas9 등을 유발 하는 다른 DNA endonucleases의 특이성도 스나이퍼-화면을 사용 하 여 향상 시킬 수 있습니다. 불행 하 게도, 스나이퍼 화면 기본 편집기 DSBs 대장균의 게놈 dna를 유도 하지 마십시오 때문에 직접, 기본 편집기의 특이성을 증가를 사용할 수 없습니다. Nickase 또는 Cas9의 그들의 시스템의 핵심에 죽은 버전을 사용 하는 기본 편집기, 스나이퍼 화면에서 얻은 안타를 사용 하 여 기본 편집기의 특이성을 증가 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 과학 부와 한국 정보 통신 (2017M3A9B4061406) 국립 연구 재단의 한국 (NRF) 한국 정부 (MSIT) (보조금 번호 2017M3A9B4061404 및 2018M3A9H3020844) Jungjoon 공화국에 의해 자금에서 교부 금에 의해 지원 되었다 리입니다. PGRG36 인코딩 플라스 미드 낸시 크레이그 (Addgene 플라스 미드 #16666)에서 선물 이었고 p11-레이스-wtx1 후 이민 자오에서 선물 했다.
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | NEB | M0290L | |
Ampicillin Sodium Salt | Fisher Chemical | BP1760-25 | |
Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma Aldrich | 37919 or 94664 | |
Antibiotic Antimycotic solution | Welgene | LS203-01 | Media component |
BamHI | Enzynomics | R003L | |
Chloramphenicol | Sigma Aldrich | R4408 | |
Diversify PCR Random Mutagenesis | Clontech | 630703 | Error-prone PCR kit |
DNA-Shuffling Kit | Jena Bioscience | PP-103 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Welgene | LM001-17 | Culture media |
Endura Electrocompetent Cells (DUO) | Lucigen | 60242-2 | E. coli electrocompetent cells for library preparation |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Welgene | S101-01 | Media component |
Gene Pulser II | Bio-Rad | E. coli electroporation equipment | |
GeneMorph II Random Mutagenesis Kit | Agilent | 200550 | Error-prone PCR kit |
genomic DNA prep kit | GenAll | 106-152 | gDNA-prep kit |
Glycerol | BioShop | GLY001.1 | |
GP/MP Cuvette, 0.1cm | Bio-Rad | BR165-2089 | E. coli electroporation equipment |
HEK293T cell | ATCC | CRL-11268 | Human cell line |
Kanamycin sulfate | Acros Organics | 450810500 | |
L-(+)-Arabinose | Sigma Aldrich | A3256-25G | |
LaboPass PCR Purification Kit | Cosmogenetech | CMR0112 | |
LaboPass Plasmid Mini | Cosmogenetech | CMP0112 | Mini-prep kit |
LB Agar Miller | Formedium | LMM0202 | |
LB Broth Miller | Formedium | LMM0102 | |
Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | Transfection reagent |
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621L | Gibson assembly (isothermal in vitro recombination) mixture |
Neon Transfection System | Thermo | MPK5000 | RNP Electroporation equipment |
Neon Transfection System 10 µL Kit | Thermo | MPK1096 | RNP Electroporation equipment |
NucleoBond Xtra Midi EF | Macherey-Nagel | 740420.50 | Midi-prep kit |
Oligo Clean & Concentrator | Zymo Research | D4061 | DNA purification kit that enables low-volume elution |
Opti-MEM | Gibco | LS31985070 | Transfection media |
p11-lacY-wtx1 | Addgene | #123945 | |
pgrg36 | Addgene | #16666 | E. coli mutator strain |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | |
Pyrophophatase | NEB | M2403L | |
Ribonucleotide Solution Set | NEB | N0450L | |
RNase inhibitor | NEB | M0314L | |
T7 RNA polymerase | NEB | M0251L | |
Turbo Dnase | Ambion | AM2238 | |
XbaI | Enzynomics | R013L | |
XL1-Red Competent Cells | Agilent | 200129 |