在这里, 我们提出了一个优化 crispr-cas9 的协议, 以实现更高的特异性, 而不会丢失目标活动。我们使用一种称为狙击手屏幕的定向进化方法来查找具有所需特征的突变 cas9。sanicper-cas9 与截断的单导轨 rna 兼容, 并以核糖核酸蛋白格式交付, 这是实现更高特性的著名策略。
将聚集在规则间隔的短回文重复 (crispr) 相关蛋白 9 (cas9) 发展成治疗方式, 需要避免其潜在的有害的离目标影响。已经制定了几种方法来减少这种影响。在这里, 我们提出了一个基于大肠杆菌定向进化方法, 称为狙击手屏幕, 以获得一个 cas9 变种与优化的特异性和保留目标上的活性, 称为狙击手-cas9。使用狙击手屏幕, 可以同时执行正面和负面选择。屏幕也可以与其他单引导 rna (sgrna) 序列重复, 以丰富真正的正面命中。通过使用 cmv-plteto1 双启动子来表示 cas9 变种, 可以在哺乳动物细胞中快速检查集合库的性能。还介绍了提高狙击手-cas9 特异性的方法。首先, 使用截断的 sgrna 以前已被证明可以增加 cas9 的特异性。与其他工程 cas9 不同, ─ cas9 与截断的 sgrna 结合使用时, 保留了野生类型 (wt) 水平的目标上活动。其次, 在不影响其目标上活动的情况下, 可以以核糖核酸蛋白 (rnp) 格式 (rnp) 形式 (而不是质粒形式) 交付 saniper-cas9。
本文旨在结合不同的策略, 提高 cas9 的特异性。已经制定了各种方法来避免 crispr-cas9 的非目标影响。例如, 截断的 sgrna 可用于实现更高的特异性1。此外, cas9 传递的方法可以从质粒格式转变为 rnp 格式, 以获得更高的特异性2。根据前面描述的合理设计,对化脓性链球菌 cas9 (spcas9) 蛋白的特定氨基酸残基进行了改性.或者 , 氨基酸残基被随机改变, 并使用酵母6或大肠杆菌7,8 筛选系统确定了特异性最高的 cas9 变种。
然而, 许多小组报告说, cas9 变种工程使用的设计, 以削弱非特异性相互作用之间的 cas9 和基板表现出低目标上的活性 7,8,9,10,11,12. 我们开发了一个基于大肠杆菌的定向进化系统–狙击手屏幕, 以随机筛选出突变的 cas9 变种。与酵母系统相比,大肠杆菌筛选系统具有优势, 因为大肠杆菌的翻倍时间较快, 转化效率较高。
在狙击手屏幕中使用了基于三种不同质粒和一个整合到大肠杆菌基因组中的感兴趣基因的负选择和阳性选择。cas9 变种是在 cmv-plteto1 双启动子系统下表达的, 这个系统的低拷贝数质粒 , 因此在大肠杆菌中识别的候选体可以在哺乳动物细胞中进行测试, 而无需亚克隆。利用 tn7 转座子系统将 goi 引入大肠杆菌基因组. sgrna 质粒, 其中包含对温度敏感的复制来源, 表达了针对goi的 sgrna;然而, sgrna 和goi序列并不完全匹配。一个完全匹配的 sgrna 靶点存在于含有 ccdb基因的第三个质粒上, 该质粒编码一种毒害旋转酶的致命产物。在该系统中, 表达具有高离目标活动的 cas9 变种的细胞被移除, 因为双链断裂 (dsb) 被引入位于基因组 dna 中的不匹配位点。另一方面, 表达 cas9 变异的细胞也被删除, 低靶向活性的ccdB基因表达。通过改变环水四环素 (atc) 的浓度, 可以改变 cas9 变种的表达水平, 从而调整选择力。
我们推断, 在基因组 dna 而不是质粒中定位不匹配的 sgrna 靶点将增加系统的灵敏度。这种方法的优点是只有一个基因组位点, 而在单个大肠杆菌细胞内会有许多质粒, 每个质粒都包含一个目标位点。
利用这个系统, 我们确定了一个 cas9 变种, sanper-cas9, 它显示了 wt 级的目标活动, 并减少了与 wt cas9 相比的非目标活动。通过使用截断的 sgrna 或基于 rnp 的交付而不是基于等离子体的交付, niper-cas9 可以实现更高的特异性比。
对于那些谁想要避免繁琐的筛选程序, 以获得 sanper-cas9, sanper-cas9 蛋白和编码质粒是可用的。利用这些材料, 应确定 sgrna 的最佳长度, 即提供最高特异性比。此外, 建议以 rnp 格式交付 niper-cas9 和 sgrna, 因为它通常比质粒格式的传递产生更高的特异性比。与 sanper-cas9 不同的是, 其他工程 cas9 变种与截断的 sgrna 6、7或 rnp 表格8的交付不兼容 (hifi-cas9 除外)。
对于狙击手屏幕, 选择不匹配的序列是最重要的一步。应避免选择与goi序列的低裂解活性相关的不匹配的 sgrna。如果没有, cas9 变种的特异性水平不会将大肠杆菌基因组 dna 与不匹配的目标位点分离。这种效应将导致大量的背景菌落, 危及整个筛选过程。
由于与酵母相比, 大肠杆菌具有较快的翻倍时间和较高的转化效率, 因此与酵母筛选方法相比, 狙击手筛网具有优势。此外, 狙击手屏幕应该比其他基于大肠杆菌的系统更敏感, 在这些系统中, 不匹配的位点被带到质粒上: 在我们的系统中有一个基因组 dna 的副本, 因此只有一个不匹配站点的副本, 但有大量的单个大肠杆菌细胞内的质粒。
其他诱导 dsb 的 dna 内切酶的特性, 如 sacas9 或 cpf1, 也可以通过使用狙击手屏幕来改善。不幸的是, 狙击手屏幕不能直接用来增加基础编辑器的特异性, 因为碱基编辑不会诱导 dsb 在大肠杆菌的基因组 dna。由于基础编辑器在其系统的核心中使用了 cas9 的镍酶或死版本, 因此可以通过使用从狙击手屏幕获得的点击率来提高基础编辑器的特性。
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了韩国科学和信息和通信技术部 (2017m3a9b4062006) 和韩国国家研究基金会 (nrf) 的赠款支持. 韩国政府 (赠款编号2017m3a9b40604 和 2017M3A9B4061406) 至 jungjoon k。李。质粒编码 pgrg36 是南茜·克雷格 (addgene 质粒 #16666) 的礼物, p11-lacy-wtx1 是赵惠民的礼物。
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | NEB | M0290L | |
Ampicillin Sodium Salt | Fisher Chemical | BP1760-25 | |
Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma Aldrich | 37919 or 94664 | |
Antibiotic Antimycotic solution | Welgene | LS203-01 | Media component |
BamHI | Enzynomics | R003L | |
Chloramphenicol | Sigma Aldrich | R4408 | |
Diversify PCR Random Mutagenesis | Clontech | 630703 | Error-prone PCR kit |
DNA-Shuffling Kit | Jena Bioscience | PP-103 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Welgene | LM001-17 | Culture media |
Endura Electrocompetent Cells (DUO) | Lucigen | 60242-2 | E. coli electrocompetent cells for library preparation |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Welgene | S101-01 | Media component |
Gene Pulser II | Bio-Rad | E. coli electroporation equipment | |
GeneMorph II Random Mutagenesis Kit | Agilent | 200550 | Error-prone PCR kit |
genomic DNA prep kit | GenAll | 106-152 | gDNA-prep kit |
Glycerol | BioShop | GLY001.1 | |
GP/MP Cuvette, 0.1cm | Bio-Rad | BR165-2089 | E. coli electroporation equipment |
HEK293T cell | ATCC | CRL-11268 | Human cell line |
Kanamycin sulfate | Acros Organics | 450810500 | |
L-(+)-Arabinose | Sigma Aldrich | A3256-25G | |
LaboPass PCR Purification Kit | Cosmogenetech | CMR0112 | |
LaboPass Plasmid Mini | Cosmogenetech | CMP0112 | Mini-prep kit |
LB Agar Miller | Formedium | LMM0202 | |
LB Broth Miller | Formedium | LMM0102 | |
Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | Transfection reagent |
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621L | Gibson assembly (isothermal in vitro recombination) mixture |
Neon Transfection System | Thermo | MPK5000 | RNP Electroporation equipment |
Neon Transfection System 10 µL Kit | Thermo | MPK1096 | RNP Electroporation equipment |
NucleoBond Xtra Midi EF | Macherey-Nagel | 740420.50 | Midi-prep kit |
Oligo Clean & Concentrator | Zymo Research | D4061 | DNA purification kit that enables low-volume elution |
Opti-MEM | Gibco | LS31985070 | Transfection media |
p11-lacY-wtx1 | Addgene | #123945 | |
pgrg36 | Addgene | #16666 | E. coli mutator strain |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | |
Pyrophophatase | NEB | M2403L | |
Ribonucleotide Solution Set | NEB | N0450L | |
RNase inhibitor | NEB | M0314L | |
T7 RNA polymerase | NEB | M0251L | |
Turbo Dnase | Ambion | AM2238 | |
XbaI | Enzynomics | R013L | |
XL1-Red Competent Cells | Agilent | 200129 |