Här presenterar vi ett protokoll för att kombinera två prov bearbetningsmetoder, högtrycks frysning och mikrovågsugn-assisted prov bearbetning, följt av minimal harts inbäddning för att förvärva data med en fokuserad ion beam Scanningelektronmikroskop (FIB-SEM). Detta framgår med hjälp av en mus tibia nerv prov och Caenorhabditis elegans.
Den beskrivna prov förberedelse tekniken är utformad för att kombinera ultrastrukturella bevarande med den lämpligaste kontrasten för bildframställning modalitet i en fokuserad ion beam Scanningelektronmikroskop (FIB-SEM), som används för att få bästa kvalitet travar av sekventiell bilder för 3D rekonstruktion och modellering. Högtrycks frysning (HPF) tillåter nära infödda strukturella bevarande, men den efterföljande frysa substitution ofta ger inte tillräcklig kontrast, särskilt för ett större exemplar, som är nödvändig för hög kvalitet imaging i SEM krävs för 3D återuppbyggnad. Därför, i detta protokoll, efter att ersätta det frysa, ytterligare kontrasterande steg utförs i rumstemperatur. Även om dessa steg genomförs i en mikrovågsugn, är det också möjligt att följa traditionella bänk bearbetning, vilket kräver längre inkubationstider. För efterföljande inbäddning i minimala mängder harts möjliggör snabbare och mer exakt inriktning och förberedelse inuti FIB-SEM. Protokollet är särskilt användbart för prover som kräver förberedelse av högtrycks frysning för en tillförlitlig ultrastrukturella bevarande men inte få tillräckligt med kontrast under frysa substitution för volym imaging använder FIB-SEM. I kombination med minimal harts bädda in, ger det här protokollet ett effektivt arbetsflöde för förvärv av högkvalitativa volymdata.
Högtrycks frysning är den prov förberedelse metoden val för att få hög kvalitet ultrastrukturella bevarande, som representerar det ursprungliga tillståndet av ett prov som är mycket bättre än konventionella beredningsmetoder som använder kemiska fixering1. Detta cryo-förberedelse metod är användbar för prover, såsom myeliniserade mus vävnad2 och ett strikt krav för användning av modellen organismen Caenorhabditis elegans3. Efter frysning substitution och harts inbäddning analyseras dessa prover vanligen av transmissionselektronmikroskopi (TEM) eller electron tomografi (ET). Om större volymer måste avbildas med FIB-SEM eller seriell block-face imaging för högupplösta storskaliga 3D rekonstruktioner, vår erfarenhet korrekt avbildning av SEM ofta hämmas av brist på kontrast. I FIB-SEM registreras vanligtvis bilden av detektion av bakåtspritt elektroner från primära elektronen strålar. Avkastningen av bakåtspritt elektroner är proportionell mot halten av tungmetaller i provet. Därför utformades särskilt protokoll för volym imaging för att förbättra kontrasten av ytterligare tungmetall impregnering. Sådana metoder är baserade på kemiskt fasta prover och tillämpa en kombination av osmium vanligtvis-thiocarbohydrazide-osmium vanligtvis4, som beskrivs av Knott et al.5, för seriell block-ansikte och fokuserade ion beam svepelektronmikroskopi. Ändringar inklusive användning av formamid och pyrogallol6 eller bly aspartat7 har framgångsrikt tillämpats för olika avbildningstekniker.
Protokollet anges här kombinerar cryo-framställning av exemplar av HPF och frysa substitution med efterföljande mikrovågsugn-assisterad behandling för förbättrad kontrast med thiocarbohydrazide/osmium vanligtvis i aceton i rumstemperatur. Vi visar detta på myeliniserade nervus tibialis möss och Caenorhabditis elegans, som representerar prover som kräver högtrycks frysning för högkvalitativa ultrastrukturella bevarande. Dessutom visas hur, efter uttorkning och infiltration, proverna är inbäddade med som lite harts som möjligt. Denna minimala harts inbäddning8 möjliggör snabbare inriktning av intresse struktur och minskar den tid som spenderas på prov behandling, inbegripet mindre tid krävs för utsätta regionen av intresse med ion balken. Efter utför ytterligare provberedningssteg inuti mikroskopet, utförs imaging och fräsning av provet kontinuerligt för att förvärva en bunt med bilder. 3D-visualisering, används bildbehandlingsprogram (IMOD) för att rekonstruera delar av datamängden.
Vårt arbetsflöde beskrivs hur den lämpligaste kontrasterande prover för volym imaging kan kombineras med bästa ultrastrukturella bevarandet av HPF och frysa substitution. Detta är användbart för prover som strikt kräver cryo-förberedelser. Program är begränsad till små prover som kan framställas genom HPF. I prover av olika karaktär, såsom växtmaterial eller mikroorganismer, kräver detta protokoll anpassning.
Protokollet har utvecklats för att illustrera optimalt bevarande och kontrast till utföra seriell block-face imaging med en FIB-SEM. Därför valde vi att tillämpa cryo-immobilisering följt av efter färgning med frysa substitution och mikrovågsugn-assisterad behandling. Detta protokoll är därför begränsad till prover som är små nog för högtrycks frysning. Storlek begränsning av 3 till 6 mm i bredd och tjocklek av ~ 200 µm fastställs av storleken på den prov transportör, som matchar den urvalsstorlek som ordentligt kan frysas med denna teknik. Detta är relevant för mus nerv provet, eftersom ischiasnerven är för stor i diameter för att passa in i 0,2 mm bärarna som krävs för att säkerställa korrekt frysning. Därför rekommenderas noggrann dissektion av en mindre nerv som tibial nerven eller andra tunna nerv såsom femoralisblockad. Eftersom myelinskidan är känslig för stretching, måste vara mycket försiktig under dissektion av färska och livskraftiga nerven att undvika hantering av artefakter. I allmänhet bör endast livskraftiga prover användas för elektron mikroskopisk studier.
Mikrovågsugn-assisterad behandling och minimal harts inbäddning är utformade för påskynda förberedelserna och inriktning process. Mikrovågsugn-assisterad behandling tillämpar en modifierad OTO protokoll4 används för rumstemperatur kemiska fixering. Mikrovågsugn hushåll kommer att inte ge samma resultat, eftersom det finns ingen homogen fördelning av mikrovågor, dess temperatur styrs inte, och det finns inga tomrum som kan tillämpas. Den mindre en prov, bättre penetration av kemikalier; Därför, bästa resultat uppnås genom mindre prover. För att undvika skador på provet av överhettning, är temperaturkontroll och tillämpningen av den nödvändiga supportinformationen mikrovågseffekten kritiska. Mikrovågsugn-assisted processtegen kan utföras på bänken om det finns ingen mikrovågsugn tillgängliga, vilket leder till längre handläggningstider. Till direkt målstrukturer i SEM är det viktigt att ta bort så mycket harts som möjligt från toppen av provet. Efter inspelning en datamängd, är efterbehandling av raw-data nödvändigt att minska filstorleken och förbättra signal-brus-förhållandet. Moderna volym avbildningstekniker producera stora mängder data. För att utföra behandling på ett snabbt och tillräckligt sätt, behövs därför tillräckligt med RAM på arbetsstationen. För justering operationer krävs minst två gånger så mycket RAM som dataset storlek.
Detta protokoll har testats på nervus tibialis på musen så väl som i C. elegans. Hall et al. 12 används en liknande förbättring steg efter deras frysa substitution på bänken för beredning av C. elegans. För alla andra modellorganism såsom Zebrafiskar är justeringar av protokollet sannolikt nödvändigt. En möjlig ändring är att ändra sammansättningen av frysa substitution cocktail, såsom genom tillsats av vatten som används för kontrast förbättring18. Dessutom varaktigheten av frysa substitution måste anpassas till provet och kan förkortas avsevärt enligt snabb frysning substitution protokoll19. En möjlighet är tillämpningen av agitation för att påskynda den frysa substitution process20. Efter att ersätta det frysa, ytterligare är ändringar möjliga, till exempel upprepad applicering av kemikalier och osmium vanligtvis21. Under mikrovågsugn bearbetning, kan den temperatur, inkubationstider och energiinställningar varieras för att optimera resultaten för respektive provet.
Detta protokoll visar att en sådan förbättring kan kombineras med andra frysa substitution protokoll och olika typer av prover som beskrivs av Hall12 som är avbildad i en FIB-SEM eller genom seriell block-face skanning elektronmikroskopi. Dessa bildgivande tekniker kräver förbättrad kontrast, vilket är mindre viktigt för transmissionselektronmikroskopi.
The authors have nothing to disclose.
De FIB-SEM och Asplund (positionen för operatorn FIB-SEM) finansieras av Cluster of Excellence och Deutsche Forschungsgemeinschafts (DFG) Research Center nanoskala Mikroskopi och molekylär fysiologi av hjärnan (CNMPB). Vi tackar labbet av Thomas Müller-Reichert för att tillhandahålla C. elegans proverna. Vi tackar Ulrich Weikert för att delta i filmen.
Instrumentation | |||
Leica HPM100 | Leica | ||
Automatic Freeze Substitution | Leica | ||
Laboratory microwave with temperature control unit | Ted Pella | ||
EM ACE600 with gold target | Leica | ||
Crossbeam 540 | Zeiss | ||
Halogen lamp 12 V/ 20 W | Osram | ||
Oven | VWR | ||
Freezing | |||
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
M9 | Homemade | According to C. Elegans- A practical approach I.A.Hope | |
Hexadecene | Sigma-Aldrich | 52276 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P2307 | |
A type carrier | Wohlwend GmbH | #241 | |
B type carrier | Wohlwend GmbH | #242 | |
Slit carrier | Wohlwend GmbH | #446 | |
Plastic Pasteur pipettes | VWR | 612-1684 | |
Forceps | FST | 11200-10 | |
Freeze substitution | |||
Acetone | science services | 10015 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
Osmium tetroxide | EMS | 19100 | |
Uranyl acetate | SPI-Chem | 02624-AB | |
Acetone | EMS | 10015 | |
Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich | 223220 | |
Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7884-450EA | |
Watch glass dishes, 150 mm | VWR | 216-2189H | |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
Durcupan resin | Sigma-Aldrich | 44610 | |
Mounting | |||
SEM stubs | Science Services | E75200 | |
Aclar | Science Services | 50425-10 | |
Toothpicks | |||
filter paper | VWR | 512-3618 | |
conductive silver resin | EMS | 12670-EE | EPO-TEK EE 129-4 |
Software | |||
Image acquisition | Zeiss | SmartSEM | |
Image acquisition | Zeiss | Atlas5 A3D | |
Image processing | Open source | Fiji | http://fiji.sc/#download |
Image visualization | Open source | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |