고압 냉동, 전자 레인지를 이용한 콘트라스트 향상, 그리고 볼륨 이미지에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지에 의해 생물학 견본 준비

여기에 설명 된 동물에서 샘플을 포함 하 여 모든 실험 고객 보호 및 식품 안전 (LAVES)에 대 한 기관 동물 관리와 낮은 색 소니의 국가 사무실에 의해 승인 되었습니다가지고. 1. 고압 및 동결 대체 마우스 (예를 들어, C57Bl6N, 12 주, 여성)9에서 nervus tibialis 해 부. 20 %polyvinylpyrrolidone (1g PVP의 5 ml에서)의 작은 물방울에 nervus tibialis 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 담가 그리고 2 m m 길이 조각을 잘라. 그런 다음, 금속 샘플 캐리어 (타입 A, 0.2 m m 깊이)에 배치 좋은 집게를 사용 하 여. 다른 플랫 캐리어 (B 타입)는 뚜껑으로 hexadecane의 얇은 층으로 코팅을 추가 하 고이 어셈블리를 견본 카트리지 삽입. 여러 선 충 C. 20% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) m 9에서의 물방울에 전송 ( 재료의 표참조)와 금속 캐리어 (타입 A) 일회용 플라스틱 피 펫. 다음, 두 번째 항공사 (B 타입) 위에 뚜껑으로 추가 하 고 카트리지를 조립. 두 샘플의 다음과 같이 진행: 고압 고압 냉동 고의 로드 역에서 쓰리 피스 카트리지에 그들을 로드 하 여 샘플 캐리어 어셈블리 하나에 의해 고정. 제조업체의 운영 지침에 따라 프로세스를 누릅니다.참고: 두 가지 유형의 샘플 이후 동결 대체에서 함께 처리할 수 있습니다. 아세톤에 냉동된 0.1% 타 닌 산의 2 개 mL를 포함 하는 cryovials에 샘플을 놓습니다. 튜브에 액체 질소를 흘리 고 없이 액체 질소의 목욕에서 전송을 수행 합니다. 이동 자동 동결 대체 단위10 에 cryovials-90 ° C에서 설정 하 고 프로그램을 시작.참고: 샘플 보관-90 ° C 100 헤 타 닌 산에서 전에 osmification 피복을 오스뮴 tetroxide11의 이해를 높이기 위해 사용 됩니다. 수동으로 세척 샘플 3 x 고정 대체 단위에서-90 ° C에서의 아세톤 2 mL와 함께 30 분에 대 한. 2% 오스뮴 tetroxide의 2 ml에서 샘플을 떠나, 자동에 지속적인 얼룩에 아세톤에 0.1 %uranyl 아세테이트 동결 7 h-90 ° c.에 대 한 대체 단위주의: 오스뮴 tetroxide 독성 연기 후드, 처리 및 보호 장비를 착용 한다.참고: 동결 대체 단위는 자동으로 온도를-20 ° C에서 5 ° C/h를 발생 시킵니다. 샘플 고정 대체 단위에 16 h-20 ° C에서 보관 됩니다. 온도 4 ° C에서 10 ° C/h에 자동으로 발생 합니다. 온도 4 ° c.에 도달 했습니다 때 순수한 아세톤과 오스뮴 tetroxide 솔루션을 교환 고정 대체 단위에서 있는 cryovials를 제거 합니다. 2. 전자 레인지 기반 처리 참고: 모든 실내 온도12 안정 된 온도 유지 하는 온도 제어 장치를 사용 하 여 다음 단계를 수행 ( 재료의 표참조). 전자 레인지에 처리 하는 동안 반응 튜브의 뚜껑 열어 둡니다. cryovials에서 금속 샘플 캐리어를가지고 고 시계 유리 접시 (150 ㎜)에 아세톤에 submersed 샘플을 유지 하면서 좋은 집게 나 바늘를 사용 하 여 금속 캐리어에서 샘플을 제거. 고급 포 셉 또는 한 피 펫을 사용 하 여 2 mL 반응 관에 샘플을 전송 하 고 4 번 40 대 한 아세톤의 1 mL로 씻어 W. 250 s주의: Thiocarbohydrazide은 독성 연기 후드 처리, 보호 장비를 착용 한다. 대비 증가 150 W에서 14 분 아세톤에서 1 %thiocarbohydrazide 1 mL와 얼룩. 얼룩을 수행 하려면 반응 관에 thiocarbohydrazide 솔루션을 플라스틱, 튜브는 전자 레인지에 놓고 2 분/2 분에서 14 분을 총 반복에 대 한 150 W의 전력 레벨을 프로그램 (진공 기능 설정)으로 설정 합니다. 전자 렌지를 시작 합니다.참고: Thiocarbohydrazide 동결 대체 하는 동안 적용 된 오스뮴 tetroxide 반응. 그것은 더 많은 오스뮴 tetroxide 원래 오스뮴 tetroxide 사이트13에 입금 될 수 있도록 다리를 형성 한다. 워시 샘플 4 x 40에 대 한 아세톤의 1 mL를 피펫으로 반응 관에 아세톤 W. 250 s 튜브는 전자 레인지에 놓고 250 W 40 s. 시작 전자 레인지에 대 한 선택. W. 피 펫 150에서 14 분 아세톤에 2% 오스뮴 tetroxide의 1 ml에서 반응 관에 오스뮴 tetroxide 솔루션 얼룩, 전자 레인지에 튜브를 놓고 2 분 동안 프로그램 150 W (진공 기능 설정)의 전력 레벨을 설정 에서/2 분 총 14 분 동안 반복. 전자 렌지를 시작 합니다. 워시 샘플 4 x 40에 대 한 아세톤의 1 mL 250 W (으로 단계 2.5에서에서) s. 1 mL 아세톤 수 지의 농도 증가 함께 침투 ( 재료의 표참조)의 25%, 50%, 75%, 90%, 100%, 그리고 3 분 각 250 W. 피 펫 반응 관에 수 지에 대 한 100%, 튜브, 전자 레인지에 놓고 전원 레벨을 설정 하는 프로그램 250 W (진공 기능 설정)와 l 3 분 전자 렌지 시작. 3. 최소한의 수 지 포함8 이쑤시개와 장소 플라스틱의 조각에 그들 ( 재료의 표참조) 영화 반응 튜브 nervus tibialis와 C. 선 충 을 가져가 라. 이쑤시개를 사용 하 여 부드럽게 밀어 샘플 플라스틱 필름에 아무 남아 있는 수 지를 감지 때까지. 할로겐 램프를 사용 하 여 난방 ( 재료의 표참조) 수 지 보다 적게 점성 된다 그래서 더 쉽게 제거 될 수 있다. 장소 할로겐 램프 (손이 태워 하지 않도록 주의 되는) 수 지를 열 정도로 닫습니다. 오븐에 플라스틱 필름 위에 60 ° C에 적어도 48 h에 대 한 샘플 유해 4입니다. 거짓말-sem의 대 한 준비 Sem의 스텁 피팅 크기에서 면도날을 사용 하 여 플라스틱 필름 함께 polymerized 샘플 잘라내어 전도성 실버 수 지를 사용 하 여 SEM 명세서에 첨부 ( 재료의 표참조). 적어도 4 h 또는 하룻밤 60 ° C에서 다시 유해. SEM에 샘플 1 분 35 골드와 스텁 스퍼터 코트 스퍼터 coater를 사용 하 여 mA (백 금/팔라듐을 사용할 수 있습니다, 10 nm 두꺼운 코팅은 충분 한) 거짓말-SEM. 내부 배치 5. 거짓말-SEM 내부 데이터 수집 현미경을 운전 하는 기본 소프트웨어를 사용 하 여 2 차 전자 검출기와 샘플 이미지 ( 재료의 표참조). 관심 (예: nervus tibialis 또는 C. 선 충의 중간 부분) 영역 보기의 필드에는 샘플 중심 이어야 한다.참고: 데이터 수집을 수행 하려면 기울기 위치로 단계 있도록 샘플 직면 한 적절 한 작동 거리 (5mm)에 90 ° 각도로 이온 빔 이온 및 전자 빔의 소위 일치 포인트. 우리의 악기를 사용 하 여이 54 °와 5mm 작동 거리 단계 기울기에서 이루어집니다. 샘플의 정확한 위치를 설정 하려면, 2 차 전자 검출기와 이미징 동안 0 ° 기울기에 일반적인 기능 센터. 천천히 54 ° (5 °, 20 ° 54 °), 기울기 상자 M-축 이동 하 여 동일한 개체를 중앙 맞춤. 54 °, 기능 거짓말 모드에서 중앙 위치로 이동 하 여 다음에 2 차 전자 검출기와 이미징 동안 기능을 중심으로 일치 점을 찾아. 센터의 표시를 SEM 소프트웨어에 십자선을 표시 하 여이 수행 합니다. 그럼 먼저 이동 샘플링 기능 이미지 영역의 중심을 SEM 소프트웨어의 센터 포인트 기능을 사용 하 여. 그런 다음 z에서 스테이지를 이동 하 여 y 축 따라 기능 센터. 거짓말과 sem의 사이 마지막 오프셋은 SEM 광속 변화 수정 되었습니다. 고급 소프트웨어를 열고 ( 재료의 표참조) 녹음 3D 데이터 집합 및 따라 단계별 소프트웨어 마법사. 관심, 예금 탄소 또는 플래티넘의 지역에서 (400 nm) 충전에 의해 유도 된도 밀링 및 아티팩트를 줄일 3 나 전류를 사용 하 여 투자 수익의 위에.참고: 거짓말 (너비, 높이, 깊이)과 몇 군데 견본 표면에 가공 하는 관심 영역을 그려서, 소프트웨어 계산 하 고 다른 샘플 준비 기능을 밀링할 참호 등 지역에 대 한의 크기를 superimposes 백 금/탄소 증 착입니다. 또한, 신중의 너무 높은 거짓말 해류와 샘플 표면 이미징이 샘플 표면 손상 시킬 수 있습니다. 50 pA의 전류는 이미징에 대 한 충분 합니다. 집중 된 이온 살을 사용 하 여 관심 (ROI) 현재 15/30 나를 사용 하 여 영역을 노출 하는 트렌치를 밀. 집중 된 이온 살을 사용 하 여 현재 7 나와 횡단면을 폴란드어. 샘플 준비를 완료 한 후 다음 이미지 매개 변수를 설정: 거짓말 거짓말 설정 탭 (거짓말 밀링 전류); 매개 변수 밀링 SEM 이미지 설정 탭에 이미지는 SEM AutoTune 탭에서 매개 변수를 튜닝 매개 변수 (자동 초점 및 autostigmation 모든 60 분 50 nm 픽셀 크기, 면만 시간 3, 평균 3 라인). 이 모든 샘플에 대 한 최적화. 실행 하는 동안 표류 하 블록 얼굴을 일으키는 어떤 열 드리프트를 방지 하려면 인수를 시작 하기 전에 적어도 2 시간에 대 한 공간을 두십시오. 연속 밀에서 데이터 집합을 수집 하 고 700 펜 실바 니 아 거짓말 현재 모드를 확보. 사용 1.5 k v (분석 모드, 900 V) ESB 얻으려고 400 V의 그리드 전압 검출기 각각 5 nm 픽셀 크기 고급 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 ( 재료의 표참조) 및 50 nm 슬라이스 두께. 하나의 이미지 수집 6 µs의 면만 시간이 약 1.5 분 걸립니다. 데이터 수집을 시작 합니다. 현재 밀링에 거짓말 이미지 샘플을 이동 하지 않았다 고 오른쪽 관심 영역을 선택 취득 된다. 필요한 경우 조정 합니다. 6. 데이터 시각화 피지에서 피지에 모든 이미지를 포함 하는 폴더를 드래그 하 여 이미지를 열고 고 가상 스택을 선택 합니다. 사각형 도구를 사용 하 여 관심 영역 자르기 (이미지 > 자르기). 어둠 속에서 나타나는 멤브레인과 전통적인 전송 전자 현미경 검사 법 대조를 보여주는 데이터를 반전 (편집 > 반전). TrackEM214 (피지15)를 사용 하 여 정렬. TrackEM2에 데이터를 로드 (파일 > 새로 만들기 > TrackEM2) 레이어를 클릭 하 여. 모든 이미지를 로드 한 후 정렬할 다층 모자이크 기능을 사용 하 여 (마우스 오른쪽 단추로 클릭 이미지 > 정렬 > 정렬 다층 모자이크). 정렬 후에 이미지 개별 tiff 파일로 내보내집니다 (마우스 오른쪽 단추로 클릭 이미지 > 내보내기 > 만들기 플랫 이미지). 모든 이미지를 내보낼 수 및 파일에 저장할선택을 선택 합니다. 후 처리에 대 한 가우스 흐림 효과 사용 하 여 (과정 > 필터 > 가우시안 흐림; 시그마 2) 및 로컬 콘트라스트 향상 (과정 > 현지 대비 향상; CLAHE: blocksize 127, 히스토그램 쓰레기통 256, 최대 경사 1.5), 이미지를 부드럽게 하 고 더 나은 신호 대 잡음 비율을 얻기에 피지에 적용 되는. 아이 모드16 수동 세분화를 수행 하 고 3D에 대 한 관심의 구조를 시각화 하는 데 사용 됩니다. 아이 모드에서 데이터 집합을 열고 드로잉 도구 를 선택 (특별 한 > 그리기 도구) 수동 세분화를 수행. 다른 수동 도구 (예: 조인, 조각) 볼륨에 걸쳐 관심의 구조에 따라 사용할 수 있습니다. 현미경 이미지 브라우저 (MIB17)를 사용 하 여 반자동된 세분화에 대 한.