JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Подготовка биологический образец высокого давления замораживания, при содействии Микроволновая печь контрастности и минимальным смолы, встраивание образов тома

Published: March 19, 2019
doi:
10.3791/59156
, ,
1Electron Microscopy Core Unit,Max Planck Institute of Experimental Medicine, 2Center Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (CNMPB)

Summary

Здесь мы представляем собой протокол для объединения двух методов обработки образца, высокого давления замораживания и образца при содействии микроволновой обработки, после чего минимальным смолы, встраивание для получения данных с целенаправленной ионного луча сканирующего электронного микроскопа (FIB-SEM). Это продемонстрировано с помощью мыши Большеберцовый нерв образца и Caenorhabditis elegans.

Abstract

Техника подготовки описан пример призван объединить лучшее качество ультраструктурных сохранения с наиболее подходящий контраст для визуализации модальности в целенаправленной ионного пучка сканирующего электронного микроскопа (FIB-SEM), который используется для получения стеки последовательных изображений 3D реконструкции и моделирования. Высокого давления, замораживания (HPF) позволяет близко к родной структурных сохранения, но последующие заморозить замены часто не обеспечивает достаточного контраста, особенно для больших образца, который необходим для высококачественных изображений в SEM, необходимых для 3D реконструкция. Таким образом, в настоящем Протоколе, после замены моратория, дополнительные контрастные шаги выполняются при комнатной температуре. Хотя эти шаги выполняются в микроволновую печь, это также можно следовать традиционной скамьи обработки, которая требуется более длительное время инкубации. Последующие вложения в минимальное количество смолы позволяет быстрее и более точной ориентации и подготовки внутри FIB SEM. Этот протокол является особенно полезным для образцов, которые требуют подготовки путем замораживания высокого давления для надежного сохранения ультраструктурных, но не получить достаточно контраст во время замораживания замены для тома изображений с помощью БМУ-SEM. В сочетании с минимальным смолы встраивание этот протокол обеспечивает эффективный рабочий процесс для приобретения высококачественных объем данных.

Introduction

Высокого давления замораживание является подготовка образца методом выбора для получения ультраструктурных сохранение высокого качества, который представляет состояние собственного образца гораздо лучше, чем обычные подготовка методы, с помощью химической фиксации1. Этот метод крио подготовка полезен для образцов ткани Миелинизированные мыши2 и строгое требование для использования модели организма Caenorhabditis elegans3. После замены замораживание и встраивание смолы эти образцы обычно анализируются просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) или электронная томография (ET). Если большие объемы должны отражаться с помощью БМУ-SEM или последовательный блок лицо изображений для высокого разрешения крупномасштабных 3D реконструкций, наш опыт показывает, что правильное изображений по SEM часто затрудняется отсутствием контраста. В FIB-SEM изображение записывается обычно обнаружение рассеяния электронов от основного электронного луча. Урожайность рассеяния электронов пропорциональна содержание тяжелых металлов в образце. Таким образом протоколы были специально разработаны для тома изображений для повышения контраста дополнительных тяжелых металлов полимерами. Такие методы основаны на химически фиксированных выборок и применять сочетание осмия тетраоксид thiocarbohydrazide осмия тетраоксид4, как описано в Knott et al.5, для последовательного блока лица и сосредоточены ионного пучка сканирующая электронная микроскопия. Изменения, включая использование формамида и пирогаллол6 или свинца аспартат7 успешно применяется для различных методов обработки изображений.

Протокол, здесь сочетает крио подготовка образцов по ЖКХ и заморозить замещения с последующей обработки для повышения контраста, используя thiocarbohydrazide/осмия тетраоксид в ацетон при комнатной температуре, при содействии Микроволновая печь. Мы демонстрируем это на tibialis Миелинизированные nervus мышей и Caenorhabditis elegans, которые представляют образцы, которые требуют высокого давления, замораживание ультраструктурных сохранения высокого качества. Кроме того показано, как, после обезвоживания и инфильтрации, образцы внедряются с как мало смолы как можно скорее. Этот минимальный смолы, встраивание8 позволяет быстрее ориентации структуры интереса и уменьшает время, затраченное на обработку образца, включая меньше времени, необходимого для предоставления региона интерес с пучком ионов. После выполнения дальнейшие действия по подготовке образца внутри Микроскоп, imaging и фрезерные образца осуществляется непрерывно приобретать стек изображений. Для 3D визуализации обработки изображений программное обеспечение (IMOD) используется для восстановления части набора данных.

Наш рабочий процесс описывает, как наиболее подходящим контрастные образцов для тома изображений может сочетаться с лучших ультраструктурных сохранения по ЖКХ и моратория замещение. Это полезно для образцов, которые строго требуют крио подготовка. Приложения ограничены небольшие образцы, которые могут быть подготовлены HPF. В образцах различной природы, такие как растительного материала или микроорганизмов этот протокол требует адаптации.

Protocol

Все эксперименты, включая образцы от животных, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и Нижней Саксонии государственного управления для защиты клиента и продовольственной безопасности (LAVES). 1. высокого давления блокирования и замораживания замещения Вскрыть tibialis nervus мыши (например, C57Bl6N, 12 недель, самка)9. Погрузите tibialis nervus в капли 20% поливинилпирролидона (1 g PVP в 5 мл) в-фосфатный буфер (PBS) и вырезать куски длиной 2 мм. Затем поместите его в металлические прободержатели (тип А, 0,2 мм глубина) с помощью тонкой щипцами. Добавьте еще один плоский перевозчика (тип B) покрыта тонким слоем гексадекан как крышкой и вставьте патрон образца этой Ассамблеи. Передача нескольких C. elegans взвешенных в капельки 20% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в M9 (см. Таблицу материалы) с одноразовые пластиковые пипетки в металлический корпус (тип A). Затем добавьте второй перевозчик как крышка на вершине (тип B) и собрать картриджа. Для обоих образцов, продолжить следующим: высокого давления замораживания образца перевозчик сборки один на один, загружая их в трехсекционный патрон в загрузки станции высокого давления морозильник. Нажмите кнопку процесса согласно инструкции по эксплуатации изготовителя.Примечание: Обоих типов образцов могут быть обработаны вместе в последующих замораживание замещения. Поместите образцы в криопробирки, содержащих 2 мл замороженных дубильной кислоты 0,1% в ацетоне. Выполните передачу в ванну жидкого азота без разливать жидкого азота во флаконы. Передача криопробирки в блок автоматического замораживания в замену10 в-90 ° C и запустите программу.Примечание: Образцы хранятся в-90 ° C для 100 h. дубильной кислоты до osmification используется как Морилка для увеличения поглощения осмия тетраоксид11. Вручную мыть образцы 3 x 30 мин с 2 мл ацетона в-90 ° C в группе замещения моратория. Оставьте образцов в 2 мл 2% осмия тетраоксид, уранила ацетата 0,1% в ацетон для дальнейшего окрашивания в автоматическом заморозить замены блока для 7 h-90 ° c.Предупреждение: осмия тетраоксид токсичных и должны быть обработаны под вытяжного шкафа, и должны носить защитное снаряжение.Примечание: Замораживание замены блока автоматически поднимает температуру до-20 ° C на 5 ° C/ч. Образцы хранятся в-20 ° C для 16 h в группе замещения моратория. Температура будет вызываться автоматически до 4 ° C на 10 ° C/ч. Обмен осмия тетраоксид решение с чистым ацетоном, когда температура достигает 4 ° C. Удаление криопробирки из блока замещения моратория. 2. при содействии микроволновой обработки Примечание: Выполнить все следующие шаги при комнатной температуре12 с помощью блока управления температуры для поддержания стабильной температуры (см. Таблицу материалы). Оставьте открытым колпачки трубы реакции во время обработки в микроволновой печи. Возьмите металла прободержателей из криопробирки и удалить образцы из металлический корпус, с помощью тонкой щипцами или иглы, сохраняя образцы submersed в ацетоне в часы стекло блюдо (150 мм). Передача образцов в 2 мл пробирок реакции с помощью тонкой щипцами или пипетки и мыть с 1 мл ацетона четыре раза для 40 s 250 Вт.Предупреждение: Thiocarbohydrazide является токсичным и должны быть обработаны под вытяжного шкафа, должны носить защитное снаряжение. Пятно образцы с 1 мл 1% thiocarbohydrazide в ацетоне 14 мин 150 W, чтобы увеличить контрастность. Для окрашивания, Пипетка решение thiocarbohydrazide в трубу реакции, поместите трубку в микроволновой печи и настроить программу на уровень мощности 150 W (с функцией вакуумной включен) для 2/2 мин от итерации для 14 мин. Запустите микроволновой печи.Примечание: Thiocarbohydrazide реагирует с осмия тетраоксид, которая применялась во время моратория замещение. Он образует мост, позволяя более осмия тетраоксид депонироваться на оригинальные сайты осмия тетраоксид13. Стирать образцы 4 x 1 мл ацетона для 40 s 250 W. пипеткой ацетона в реакции трубку, поместите трубку в микроволновой печи и выберите пункт 250 Вт для 40 s. старта микроволновой печи. Пятно в 1 мл 2% осмия тетраоксид в ацетоне 14 мин 150 Вт пипеткой осмия тетраоксид решения в реакции трубку, поместите трубку в микроволновой печи и настроить программу на уровень мощности 150 W (с функцией вакуумной включен) для 2 мин/2 мин от , итерации для 14 мин. Запустите микроволновой печи. Стирать образцы 4 x 1 мл ацетона для 40 s на 250 Вт (как это сделано в шаге 2.5). Проникнуть в 1 мл увеличения концентрации смолы в ацетоне (см. Таблицу материалы) 25%, 50%, 75%, 90%, 100% и 100% за 3 мин 250 W. дозатор смолы в реакции трубку, поместите трубку в микроволновой печи и установить программу для питания Леве l 250 Вт (с функцией вакуумной включен) на 3 мин начать Микроволновая печь. 3. Минимальный смолы, встраивание8 Возьмите nervus tibialis и C. elegans из трубки реакции с зубочисткой и место их на кусок пластиковой пленки (см. Таблицу материалы). Используйте зубочистку для аккуратно вставьте образец на пленку пока не обнаружено никаких оставшихся смолы. Используйте галогенная лампа для отопления (см. Таблицу материалы), поэтому смола становится менее вязкой и возможность более легко снимается. Место галогенная лампа достаточно близко, чтобы нагреть вверх смолы (будьте осторожны, чтобы не обжечь руки). Полимеризоваться образцы для по крайней мере 48 часов при температуре 60 ° C на верхней части пластиковой пленки в духовке. 4. Подготовка к FIB-SEM Вырезать полимеризованной образцы вместе с пластиковой пленки с помощью лезвия бритвы на размер установки заглушки SEM и прикрепить их к SEM заглушки с помощью проводящая Серебряная смолы (см. Таблицу материалы). Полимеризоваться снова при 60 ° C для по крайней мере 4 h или на ночь. Распыления пальто образцы на SEM заглушки с золотом за 1 мин 35 мА с помощью распыления нанесения покрытий (платины/палладия также могут быть использованы; 10 Нм толщиной покрытия достаточно) и поместите их в FIB SEM. 5. сбор данных внутри FIB-SEM Изображения образцов с детектор электронов средней, с использованием базового программного обеспечения, вождение микроскопа (см. Таблицу материалы). Образца должна быть ориентирована таким образом, что регион интерес (например, средняя часть nervus tibialis или C. elegans) находится в поле зрения.Примечание: Для выполнения сбора данных, наклона этап на позицию так, что образец сталкивается ионного пучка под углом в 90° на соответствующем расстоянии рабочей (5 мм) в так называемой совпадение точки пучка ионов и электронов. С помощью нашего инструмента, это достигается на стадии наклона 54° и 5 мм Рабочее расстояние. Чтобы настроить правильное положение образца, центр общей чертой на 0° наклона при визуализации с детектор средних электронов. Медленно наклона 54 ° (5°, 20°, 54°), recentering и тот же объект, перемещая М-оси. Найти совпадение точки центрирования функции при визуализации с детектор средних электронов на 54°, а затем перемещая функцию центральное место в режиме FIB. Выполните это, показывая перекрестья в SEM программное обеспечение, чтобы иметь представление центра. Тогда сначала переместите выбранный образец компонента в центр области изображения с помощью функции точки центр SEM программного обеспечения. Затем центр функцию по оси y, перемещая сцене в z. Любое окончательное смещение между FIB и SEM корректируется с SEM луч сдвига. Открыть расширенный программного обеспечения (см. Таблицу материалы) для записи 3D наборов данных и следуйте шаг за шагом мастера программного обеспечения. В регионе интереса, депозит углерода или платины (400 Нм) на вершине ROI использованием 3 nA текущего разрешить даже фрезерные и уменьшить артефакты индуцированных зарядки.Примечание: Путем рисования региона, представляющих интерес для фрезерования на поверхности образца, отображаемого с FIB (ширина, высота, глубина), программное обеспечение вычисляет и начитан размеров различных образцов подготовка функций, таких как траншеи, чтобы быть фрезерованные или области для Платина/углерода осаждения. Кроме того будьте осторожны изображений поверхности образца с слишком высокие токи FIB, как это может повредить поверхности образца. Ток 50 ПА является достаточным для изображений. Используйте целенаправленного ионный луч для стан траншею подвергать региона интерес (ROI) с помощью 15/30 nA текущей. Используйте целенаправленный ионный луч для полировки сечения с 7 nA текущей. После окончания подготовки пробы, установите следующие параметры изображений: FIB фрезерные параметры на вкладке Настройка FIB (FIB фрезерования тока); Визуализации параметров на вкладке установки и изображения, Настройка параметров на вкладке SEM AutoTune SEM (выполнения автофокусировки и autostigmation каждые 60 мин, размер пикселя 50 Нм, продолжительность 3, строка средняя 3). Оптимизируйте это для каждого образца. Чтобы предотвратить любой тепловой дрейф, вызывая блок лицо дрейф во время выполнения, оставьте место для по крайней мере 2 ч до начала приобретения. Получить набор данных в непрерывный стан и приобрести режим с 700 ПА FIB текущей. Использование 1,5 кв (аналитический режим, 900 V) детектор ESB с напряжением 400 V приобрести Сетка Фото с 5 размер пикселя Нм, используя передовые программное обеспечение (см. Таблицу материалы) и 50 Нм толшины. Приобретение одного изображения занимает около 1,5 мин с продолжительность 6 МКС. Начало сбора данных. FIB изображение на фрезерные текущего приобретается обеспечить образца не двигаться и выбран правильный области интереса. При необходимости отрегулируйте. 6. а. Визуализация Откройте изображения в Фиджи, перетащив папку, содержащую все изображения в Фиджи и выберите Виртуальный стек. Обрезка области интереса, используя инструмент прямоугольник (изображение > урожай). Инвертировать данные, чтобы показать контраст традиционной передачи электронной микроскопии с мембранами, показывая вверх в темноте (Редактировать > Инвертировать). Использование TrackEM214 (15Фиджи) для выравнивания. Загрузить данные в TrackEM2 (Файл > Новый > TrackEM2), щелкнув на слое. После загрузки всех изображений, привести их в соответствие с помощью многослойной мозаика функции (щелкните правой кнопкой мыши на изображение > Align > Выровнять многослойных мозаика). После выравнивания, изображения экспортируются в отдельные файлы tiff (щелкните правой кнопкой мыши на изображение > Экспорт > сделать плоский образ). Выберите все изображения, которые должны быть экспортированы и выберите сохранить в файл. Для пост-обработки, используйте Гауссу (процесс > Фильтры > Gaussian blur; Сигма 2) и локальное улучшение контраста (процесс > повышения локального контраста; CLAHE: blocksize 127, гистограмма бункеров 256, максимальный наклон 1.5), которые применяются в Фиджи для сглаживания изображения и получить лучшее соотношение сигнал шум. IMOD16 используется для выполнения ручной сегментации и визуализировать структуру интереса к 3D. Откройте набор данных в IMOD и выберите инструменты рисования (Специальные > инструменты рисования) для выполнения ручной сегментации. Различные ручные инструменты могут использоваться для следовать структуре интерес во всем объеме (например, соединения, лепить). Используйте браузер изображений микроскопии (17МБ) для полуавтоматического сегментации.

Representative Results

Рабочий процесс начинается с образцом (здесь, tibialis nervus свежезаваренным расчлененных мыши) в металлических перевозчиков для замораживания высокого давления (рис. 1a). Перевозчики оправился от жидкого азота (рис. 1b) и помещается в блок замены заморозить на вершине замороженных первый химический коктейль (рис. 1С). После длительного замораживания замены протокола, включая 2% осмия тетраоксид и 0,1% ацетат уранилнитрата, образцы удаляются из перевозчиков при комнатной температуре (рис. 1 d). Для дальнейшего повышения контраста, образцы будут переданы пластиковые трубы для обработки в микроволновой печи (Рисунок 1e). Вакуумной камеры и блок управления температуры используются для оптимизации процесса (Рисунок 1f). Чтобы иметь возможность выполнить встраивание минимальный смолы, зубочистки и листы пластиковой пленки необходимы (рис. 2a). После проникновения образцы смолой с помощью микроволновой печи, они размещены на куски пластиковой пленки и двигался до тех пор, пока не смолы остается на поверхности образца. Галогенная лампа используется для слива оставшиеся смолы и оставить образец минимально встроенных (Рисунок 2Б) на пластиковой пленки. Следует отметить, что больше смолы, удалены из верхней части образца является хорошим. По-прежнему должно быть небольшое количество слева под образец, чтобы держать его с подложкой. Этот образец полимеризуется на пленку вырезать и монтируется поверх SEM заглушки с серебряные проводящих смолы (рис. 2 c). Заглушки полимеризуется по крайней мере 4 часа при температуре 60 ° C (Рисунок 2d). Компоненты должны быть тщательно перемешивают, или смесь не может правильно полимеризоваться. Чтобы избежать зарядки внутри сканирующий электронный микроскоп, заглушки — кляксы с покрытием золотом или платины/палладия (Рисунок 2e). Образцы помещаются в FIB-SEM и образы с детектор средних электронов для региона интерес (рис. 3ae). Ионный луч используется для удаления материала непосредственно перед региона интерес подвергать поперечного сечения (Рисунок 3b-d, 3f-h). Стандартные протоколы часто страдают от недостатка контрастности мембраны (Рисунок 3bf), в то время как расширение протокола обеспечивает сильное мембраны контраст (рис. 3 c-d, 3 g-h). ЕТ данных (после пост-обработки) визуализируются с помощью IMOD, обработки изображений и моделирования программа. Для достижения лучшего понимания 3D информации, используется виртуальный reslicing данных (рис. 4a). Различные структуры набора данных разбиваются вручную (рис. 4b-d). Рисунок 1: высокого давления замораживания, замораживание замены и при содействии микроволновой обработки. () образец перевозчика, содержащие tibialis nervus мыши, шкалы бар 3 mm. (b) прободержатели содержащие tibialis nervus мыши после высокого давления замораживания, шкалы бар 3 мм. (c) Автоматическое замораживание замещения (AFS) единицы с образцами. Вставка: по заказу металлический контейнер для до 23 образца флаконов и два больших флаконов, содержащих химические вещества в АФН. (d) образцы, удаляется из перевозчиков в стеклянную посуду в ацетоне, масштаб бар 3 мм (e) образцы реакции Пробирки положить в микроволновой печи для обработки. (f) вакуумной камеры и терморегулирование устройство микроволновой печи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2: встраивание минимальный смолы и подготовка к FIB-SEM. () полиэтиленовой пленкой и зубочистками, которые используются для минимальной смолы встраивание, шкалы бар 4 cm. (b) Nervus tibialis осушенных смолы на верхней части пластиковой пленки, шкалы бар 250 мкм. (c) Nervus tibialis полимеризуется на пленку, а затем вырезать и монтируется поверх SEM заглушки с серебряные проводящих смолы, шкалы бар 250 мкм. (d) образцы полимеризуется на вершине SEM заглушки, шкала 3 мм бар. (e) образцы, покрытые золотом на SEM заглушки, шкалы бар 3 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3: Подготовка образца внутри FIB-SEM. (и e) Электрон средних изображения внутри SEM-FIB образца поверхности () Nervus tibialis, шкалы бар 100 µm. (e) C. elegans, шкалы бар 2 мкм (b-d) и (f-h) сечение через образец с помощью ESB детектор для изображений. (b и c) Nervus tibialis, масштаб бар 2 мкм. (f и g) C. elegans, шкалы бар 1 мкм и 200 Нм. (b и f) Приведены результаты высокого давления блокирования и замораживания замены без расширения, тогда как все другие изображения показывают результаты повышения моратория замещение. (d и h) Детальное изображение образца с помощью детектора ESB. (d) tibialis Nervus, шкалы бар 200 Нм. (h) C. elegans, шкалы бар 200 Нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 4: приобретение и визуализации изображений. (a) ет данные, отображаемые в IMOD с практически resliced x / z и y/z самолеты, масштаб бар 2 мкм. (b) сегментированных аксоны на EM данных (синий), Remak связки (красный), миелиновой оболочки (желтый и оранжевый) и митохондрии (бирюзовый), масштаб бар 2 мкм. (c и d) 3D-модель, шкалы бар 2 мкм и 500 Нм . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Протокол был разработан для иллюстрации оптимальное сохранение и контраст для выполнения последовательного блока лицо изображений с FIB SEM. Поэтому мы решили применить крио иммобилизация следуют после окрашивания с использованием замораживания замещения и при содействии микроволновой обработки. Таким образом этот протокол ограничивается образцы, которые малы достаточно для высокого давления замораживания. Размер образца перевозчика, который соответствует размер выборки, которые могут быть должным образом заморожены с этой техникой устанавливаются ограничения размера 3-6 мм в ширину и толщину ~ 200 мкм. Это актуально для мыши образец нерва, так как седалищный нерв является слишком большой диаметр вписываются в 0,2 мм перевозчиков, которые необходимы для обеспечения надлежащего замораживания. Поэтому рекомендуется тщательное рассечение меньше нерва как большеберцового нерва или других тонких нерва как бедренного нерва. Так как Миелиновые оболочки чувствителен к протягивать, необходимо быть осторожность во время вскрытия нерва свежий и жизнеспособной чтобы избежать обработки артефактов. В общем только жизнеспособные образцы должны использоваться для электрона микроскопических исследований.

При содействии микроволновой обработки и встраивании минимальное смолы предназначены для ускорения подготовки и ориентации процесса. При содействии микроволновой обработки, применение модифицированных OTO протокол4 используется для химической фиксации комнатной температуры. Бытовая Микроволновая печь не даст те же результаты, поскольку существует не равномерное распределение микроволновые печи, ее температура не контролируется, и существует не вакуум, который может быть применен. Чем меньше пробу, лучшего проникновения химических веществ; Таким образом наилучшие результаты достигаются путем небольших выборок. Чтобы избежать повреждения образца от перегрева, контроль температуры и минимально необходимые микроволновой энергии являются критическими. Шаги при содействии микроволновой обработки могут выполняться на скамейке, если есть нет Микроволновая печь доступна, который приведет к больше время обработки. Для непосредственно целевых структур в SEM важно удалить столько смолы как можно из верхней части образца. После записи набора данных, пост-обработки raw-данных необходимо уменьшить размер файла и улучшить соотношение сигнал шум. Методы визуализации современный объем производят большое количество данных. Таким образом чтобы выполнить обработку данных быстро и достаточным образом, необходим достаточно ОЗУ на рабочей станции. Для операций выравнивания по крайней мере в два раза больше оперативной памяти, как размер набора данных не требуется.

Этот протокол был протестирован на tibialis nervus мыши, а также C. elegans. Холл и др.. 12 используется аналогичный шаг повышение после их замещения моратория на скамейке для приготовления C. elegans. Для любого другого модель организма, например, данио рерио корректировок к протоколу, вероятно, необходимо. Один из возможных изменений заключается в изменении состава коктейль, такие как замораживание замены путем добавления воды, которая используется для повышения контраста18. Кроме того Продолжительность моратория замещение должна быть адаптирована к образцу и может быть существенно сокращен согласно протоколу замены быстрого замораживания19. Одним из возможных вариантов является применение агитации для ускорения процесса замещения моратория20. После замены моратория дальнейшие изменения возможны, например неоднократного применения повышения химических веществ и осмия тетраоксид21. При микроволновой обработке, можно варьировать температуру, время инкубации и параметры питания для оптимизации результатов для соответствующего образца.

Этот протокол показывает, что такое повышение может сочетаться с другими протоколы замены замораживания и различные виды образцов, как описано в зал12 , которые отражаются в FIB-SEM или последовательный блок лицо растровая электронная микроскопия. Эти методы визуализации требуют расширенной контраст, который является менее важным для просвечивающей электронной микроскопии.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

FIB-SEM и а.с. (положение оператора FIB-SEM) финансируются кластера передового опыта и Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) исследовательский центр наноразмерных микроскопии и молекулярной физиологии мозга (CNMPB). Мы благодарим лаборатории Томас Мюллер-Reichert за предоставление образцов C. elegans . Мы благодарим Ulrich Weikert за участие в фильме.

Materials

Instrumentation
Leica HPM100 Leica
Automatic Freeze Substitution Leica
Laboratory microwave with temperature control unit Ted Pella
EM ACE600 with gold target Leica
Crossbeam 540 Zeiss
Halogen lamp 12 V/ 20 W Osram
Oven VWR
Freezing
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2153
M9 Homemade According to C. Elegans- A practical approach I.A.Hope
Hexadecene Sigma-Aldrich 52276
Polyvinylpyrrolidone Sigma-Aldrich P2307
A type carrier Wohlwend GmbH #241
B type carrier Wohlwend GmbH #242
Slit carrier Wohlwend GmbH #446
Plastic Pasteur pipettes VWR 612-1684
Forceps FST 11200-10
Freeze substitution
Acetone science services 10015
Tannic acid Sigma-Aldrich 403040
Osmium tetroxide EMS 19100
Uranyl acetate SPI-Chem 02624-AB
Acetone EMS 10015
Thiocarbohydrazide Sigma-Aldrich 223220
Nunc CryoTubes Sigma-Aldrich V7884-450EA
Watch glass dishes, 150 mm VWR 216-2189H
Eppendorf tubes Eppendorf 0030 120.094
Durcupan resin Sigma-Aldrich 44610
Mounting
SEM stubs Science Services E75200
Aclar Science Services 50425-10
Toothpicks
filter paper VWR 512-3618
conductive silver resin EMS 12670-EE EPO-TEK EE 129-4
Software
Image acquisition Zeiss SmartSEM
Image acquisition Zeiss Atlas5 A3D
Image processing Open source Fiji http://fiji.sc/#download
Image visualization Open source IMOD http://bio3d.colorado.edu/imod/
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).
  2. Möbius, W., Nave, K. -. A., Werner, H. B. Electron microscopy of myelin: Structure preservation by high-pressure freezing. Brain Research. 1641, 92-100 (2016).
  3. Mancuso, J., Lich, B., McDonald, K. Three-Dimensional Reconstruction Methods for Caenorhabditis elegans Ultrastructure. Methods in Cell Biology. 96, 331-361 (2010).
  4. . NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy Available from: https://www.ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol (2010)
  5. Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue. Journal of Visualized Experiments. (53), e2588 (2011).
  6. Eberle, A. L., et al. High-resolution, high-throughput imaging with a multibeam scanning electron microscope. Journal of Microscopy. 259 (2), 114-120 (2015).
  7. Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nature Communications. 6, 1-7 (2015).
  8. Schieber, N. L., et al. Minimal resin embedding of multicellular specimens for targeted FIB-SEM imaging. Methods in Cell Biology. 140, (2017).
  9. Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection – a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. Journal of Visualized Experiments. (81), e50657 (2013).
  10. Möbius, W., et al. Electron Microscopy of the Mouse Central Nervous System. Methods in Cell Biology. 96, 475-512 (2010).
  11. Hayat, M. A. . Stains and Cytochemical Methods. , (1993).
  12. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  13. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  16. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLoS Biology. 14 (1), 1-13 (2016).
  17. Walther, P., Ziegler, A. Freeze substitution of high-pressure frozen samples: The visibility of biological membranes is improved when the substitution medium contains water. Journal of Microscopy. 208 (1), 3-10 (2002).
  18. Mcdonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243 (3), 227-233 (2011).
  19. Reipert, S., et al. Agitation Modules: Flexible Means to Accelerate Automated Freeze Substitution. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. , (2018).
  20. Lešer, V., Drobne, D., Pipan, &. #. 3. 8. 1. ;., Milani, M., Tatti, F. Comparison of different preparation methods of biological samples for FIB milling and SEM investigation. Journal of Microscopy. 233 (2), 309-319 (2009).

Tags

High-pressure FreezingMicrowave-assisted Contrast EnhancementMinimal Resin EmbeddingVolume ImagingFocused Ion Beam Scanning Electron MicroscopeUltrastructure PreservationFreeze SubstitutionOsmium TetroxideUranyl AcetateSample PreparationNervus Tibialis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Steyer, A. M., Ruhwedel, T., Möbius, W. Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging. J. Vis. Exp. (145), e59156, doi:10.3791/59156 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image