Fagocitose de macrófagos alveolares e apuramento de bactérias em ratos
Summary
Aqui nós relatamos métodos comuns para analisar a função fagocitária de macrófagos alveolares murino e apuramento bacteriano do pulmão. Esses métodos estudam in vitro fagocitose dos grânulos de isotiocianato de fluoresceína e fagocitose in vivo de Pseudomonas aeruginosa verde proteína fluorescente. Também descrevemos um método para limpar p. aeruginosa em camundongos.
Abstract
Macrófagos alveolares (AMs) guardam o espaço alveolar do pulmão. Fagocitose por AMs tem um papel fundamental na defesa contra a invasão de agentes patogénicos, a remoção de células mortas ou partículas estranhas e na resolução de respostas inflamatórias e remodela o tecido, processos que são mediadas por diversos receptores de superfície de o AMs. Aqui, nós relatamos métodos para a análise da função fagocitária do AMs usando estratégias experimentais e ensaios in vitro e in vivo para diferenciar os receptores de reconhecimento padrão-, complemento do receptor e gama Fc mediada fagocitose. Finalmente, discutimos um método para estabelecer e caracterizar um modelo de uma pneumonia de p. aeruginosa em camundongos para avaliar bacteriana liberação in vivo. Estes ensaios representam os métodos mais comuns para avaliar funções AM e também podem ser usados para estudar a função de macrófagos e liberação bacteriana em outros órgãos.
Introduction
MGA é os principais fagócitos residentes no alvéolo na fase de repouso e um dos principais players de inatas respostas imunes através do reconhecimento e internalização dos patógenos inalados e partículas estranhas1,2. Tem sido relatado que AMs são essenciais para a habilitação rápida de muitos patógenos pulmonares tais como p. aeruginosa e Klebsiella pneumonia3,4, por uma deficiência na fagocitose AM muitas vezes resulta em respiratória infecções, como pneumonia aguda, que causam maiores taxas de mortalidade e morbidade.
AMs também iniciar inatas respostas inflamatórias no pulmão através da produção de citocinas e quimiocinas como TNF-α e IL-1 β, que conversa cruzada com outras células do ambiente alveolar para produzir quimiocinas e recrutar inflamatórios neutrófilos, monócitos, e células do sistema imunológico adaptativas no pulmão5. Por exemplo, a IL-1 β, produzido por AMs ajuda a prime a liberação do neutrófilos chemokine CXCL8 de células epiteliais6. Além disso, AMs contribuam para a fagocitose de apoptotic leucócitos polimorfonucleares (PMN), falha de que leva para o escapamento sustentado de enzimas intracelulares de PMN ao tecido circundante, resultando em danos nos tecidos e inflamação prolongada 7 , 8 , 9.
Fagocitose por AMs é mediada por um reconhecimento direto de padrões moleculares associados patógeno na superfície do patógeno pelos receptores de reconhecimento padrão (PRRs) do AMs ou pela ligação de patógenos opsonized com receptores efetoras imune da AMs 10. por último, AMs podem reconhecer os alvos opsonizados com imunoglobulina (IgG) através de seus receptores Fcγ (FcγR) ou os patógenos revestidos com fragmentos de complemento, C3b e C3bi, através de seus receptores de complemento (CR)11. Entre receptores de complemento, o CR da superfamília imunoglobulina (CRIg) seletivamente é expresso em macrófagos de tecido12, e uma recente descoberta destacou o papel do CRIg na fagocitose do AM no contexto de pneumonia de p. aeruginosa 13.
Muitos estudos originais usam métodos para avaliar a fagocitose de macrófagos para descrever os mecanismos moleculares do macrófago função14,15. No entanto, métodos como fagocitose in vivo requerem uma quantificação exacta da fagocitose. Aqui, podemos resumir uma metodologia detalhada para a fagocitose in vitro e in vivo usando o isotiocianato de fluoresceína (FITC)-pérolas de vidro e proteína de p. aeruginosa verde fluorescente (GFP), respectivamente. Além disso, vamos explicar o método de diferenciação entre PRR, CR e fagocitose mediada por FcγR. Finalmente, nós relatamos um método para caracterizar o apuramento bacteriano no mouse no que diz respeito uma pneumonia de p. aeruginosa .
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante a execução de uma função de troca de gás, o pulmão persistentemente confronta alérgenos, patógenos e partículas estranhas. AMs fornecem a primeira linha de defesa em virtude da sua função principal, ou seja a fagocitose. AMs também coordenam com outras células do sistema imunológico em destruir os patógenos e na resolução da inflamação. Aqui, descrevemos os métodos para avaliar especificamente a fagocitose por AMs isolada do pulmão do rato. O protocolo apresentado neste manuscrito explica um …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pela concessão de R01HL116826 para X. Zhao.
Materials
| 18-G Needle | Nipro Medical | CI+1832-2C | Molecular Biology grade |
| 2,7-diaminofluorene (DAF) | Sigma-Aldrich | D17106 | Molecular Biology grade |
| 70% Ethanol | Decon Labs Inc. | 18C27B | Analytical grade |
| 96-well plate | Corning | 3603 | Cell Biology grade |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492 | Molecular Biology grade |
| Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle | Thermofisher Scientific | Z23373 | Molecular Biology grade |
| C5 deficient serum | Sigma-Aldrich | C1163 | Biochemical reagent |
| Centrifuge | Labnet International | C0160-R | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher Scientific | A78300101 Issue 11 | |
| DMEM Cell Culture Media | Gibco | 11995-065 | Cell Biology grade |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | Cell Biology grade |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Jo Software | FlowJo, LLC | ||
| Forceps | Dumont | 0508-SS/45-PS-1 | Suitable for laboratory animal dissection |
| FITC-carboxylated latex beads | Sigma-Aldrich | L4530 | Cell Biology grade |
| GFP-P. aeruginosa | ATCC | 101045GFP | Suitable for cell infection assays |
| Glass bottom dish | MatTek Corp. | P35G-0.170-14-C | Cell Biology grade |
| High-Pressure Syringe | Penn-Century | FMJ-250 | Suitable for laboratory animal use |
| Homogenizer | Omni International | TH-01 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | Analytical grade |
| Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX73 | |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | CA-2904 | Pharmaceutical grade |
| Shandon Kwik-Diff Stains | Thermofisher Scientific | 9990700 | Cell Biology grade |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425 | Molecular Biology grade |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1427 | Molecular Biology grade |
| MicroSprayer Aerosolizer | Penn-Century | IA-1C | Suitable for laboratory animal use |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagent grade |
| PBS | Gibco | 20012-027 | Cell Biology grade |
| rabbit anti-SRBC-IgG | MP Biomedicals | 55806 | Suitable for immuno-assays |
| rabbit anti-SRBC-IgM | Cedarline Laboratories | CL9000-M | Suitable for immuno-assays |
| Scissors | Miltex | 5-2 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | LS-2 | Suitable for laboratory animal use |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | BioRad | 1610301 | Analytical grade |
| Spring Scissors (Med) | Fine Science Tools | 15012-12 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Spring Scissors (Small) | Fine Science Tools | 91500-09 | Suitable for laboratory animal dissection |
| sheep red blood cells (SRBCs) | MP Biomedicals | 55876 | Washed, preserved SRBCs |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | Molecular Biology grade |
| Xylazine | Akorn Animal Health | 59399-110-20 | Pharmaceutical grade |
Referências
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