Summary

치경 대 식 세포 식 균 작용 및 생쥐에서 박테리아 클리어런스

Published: March 02, 2019
doi:

Summary

여기 우리 보고 murine 치경 대 식 세포와 폐에서 세균성 클리어런스 phagocytic 기능을 분석 하는 일반적인 방법. 이러한 방법을 연구 fluorescein isothiocyanate 구슬의 생체 외에서 먹어서 및 녹 농 균 녹색 형광 단백질의 vivo에서 먹어서. 우리는 또한 쥐에 피 녹 농 균 을 삭제 하는 방법을 설명 합니다.

Abstract

치경 세포 (AMs)는 폐의 폐 포 공간 경비. AMs에 의해 먹어서 침입 병원 체, 죽은 세포 또는 외국 입자의 제거에 대 한 방어에 중요 한 역할을 한다 그리고 염증 반응과 조직 리 모델링의 해상도, 처리의 다양 한 표면 수용 체에 의해 중재 AMs입니다. 여기, 우리는 패턴 인식 수용 체-, 보완 수용 체 및 Fc 감마 수용 체-중재를 생체 외에서 그리고 vivo에서 분석 실험 및 실험적인 전략을 사용 하 여 AMs의 phagocytic 기능 분석에 대 한 방법을 보고합니다 식 균 작용입니다. 마지막으로, 설정 하 고 세균성 클리어런스 vivo에서 평가 하기 위해 쥐에 피 녹 농 균 폐 렴 모델을 특성화 하는 방법을 다루겠습니다. 이 분석 실험 오전 기능을 평가 하는 가장 일반적인 방법을 대표 하 고 또한 대 식 세포 기능 및 다른 기관에서 세균 정리를 공부 하는 데 사용 수 있습니다.

Introduction

AMs는 휴식 단계와 중 인정을 통해 타고 난 면역 반응의 주요 선수와 흡입된 병원 체와 외국 입자1,2의 국제화에는 폐 포에서 주요 거주 식 세포. 그것은 알려졌다 그래서 오전 먹어서 결핍 호흡에 종종 결과 AMs P. 녹 농 균Klebsiella 폐 렴3,4, 등 많은 폐 병원 균의 급속 한 정리를 위한 필수적입니다. 감염, 급성 폐 렴과 같은 더 높은 사망률과 병 적 속도 일으킬.

AMs는 또한 cytokines 및 발산 TNF-α, IL 1β, 생산 발산 하 여 염증 성 호 중구, monocytes, 모집 치경 환경의 다른 세포와는 누화 등을 생산 하 여 폐에 타고 난 선 동적인 응답을 시작 하 고 적응 면역 세포 폐5에. 예를 들어 IL 1β AMs 제작한6상피 세포 호 중구 chemokine CXCL8의 릴리스를 도움이 됩니다. 또한, AMs apoptotic polymorphonuclear 백혈구 (PMNs)의 먹어서 주변 조직, 조직 손상의 결과로, 장기 염증 PMNs에서 세포내 효소의 지속적인된 유출에는 리드의 실패에 기여 7 , 8 , 9.

AMs에 의해 식 균 작용은 AMs의 패턴 인식 수용 체 (호흡기)에 의해 또는 AMs의 수용 체 면역 이펙터와 opsonized 병원 체의 바인딩에 의해 병원 체 표면에 병원 체 관련 된 분자 패턴의 직접 인식 하 여 중재 10. 후자의 경우, AMs 그들의 Fcγ 수용 체 (FcγR)를 통해 면역 글로불린 (IgG)와 opsonized 목표를 인식할 수 또는 병원 체 코팅 보수 조각, C3b 및 C3bi, 그들의 보완의 수용 체를 통해 (CR)11. 보충 수용 체 중 면역 글로불린의 superfamily (CRIg)의 CR은 선택적으로 조직 세포12, 나타나며 최근 발견에 피 녹 농 균 폐 렴의 맥락에서 오전 먹어서 CRIg의 역할 강조 13.

많은 원래 연구 메서드를 사용 하 여 대 식 세포 기능14,15의 분자 메커니즘을 설명 하기 위해 대 식 세포 식 균 작용을 평가. 그러나, vivo에서 먹어서 같은 방법 식 균 작용의 정확한 정량화를 해야합니다. 여기, 우리 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 먹어서 fluorescein isothiocyanate (FITC)를 사용 하 여에 대 한 상세한 방법론 요약-유리 구슬과 피 농 균 녹색 형광 단백질 (GFP), 각각. 또한, 우리 PRR, CR 및 FcγR 중재 먹어서 가운데 차별화 하는 방법을 설명 합니다. 마지막으로, 우리는 피 농 균 폐 렴에 대해 마우스에 세균 정리 하는 방법을 보고 합니다.

Protocol

이 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 동부 버지니아 의과대학의의 지침을 따릅니다. 1. 형광 구슬 먹어서 안락사는 마우스 (C57BL/6J, 6 주 오래 된, 여성) 동물의 윤리 안락사에 대 한 IACUC 프로토콜에 의하여 CO2 질에 의해. 종이 수건으로 커버 해 부 보드에 아랫 배 위로 마우스를 놓는다. Spread-eagle 그것의 사지와 그것의 발을 파악 하 고 그것…

Representative Results

우리는 먼저 마우스에 의해 식 균 작용을 분석 하는 실험을 수행 기본 AMs. 모든 분석을 통해 우리는 AMs WT 및 TRIM72코 쥐에서 고립 된 비교. 그림 1A같이 형광 현미경 검사 법 기본 AMs 외피의 1 시간 후 발생 하는 마우스를 먹어서 FITC 유리 구슬의 공개. 그림 1 B cytometry에 의해 식 균 작용의 분석을 ?…

Discussion

가스 교환 기능을 수행 하는 동안 폐 지속적으로 외국 입자, 병원 체, 및 알레르기 증상을 직면 한다. AMs는 그들의 주요 기능, 즉 먹어서 덕택으로 방어의 첫 번째 줄을 제공합니다. AMs는 또한 다른 면역 세포는 병원 체를 파괴와 염증의 해상도 함께 조정. 여기, 우리가 구체적으로 AMs 마우스 폐에서 분리 하 여 식 균 작용을 평가 하기 위한 방법을 설명 합니다. 이 원고에 프로토콜 먹어서 vivo에서 그…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 그랜트 R01HL116826 X. Zhao에 의해 지원 됩니다.

Materials

18-G Needle Nipro Medical  CI+1832-2C Molecular Biology grade
2,7-diaminofluorene (DAF) Sigma-Aldrich D17106 Molecular Biology grade
70% Ethanol Decon Labs Inc. 18C27B Analytical grade
96-well plate Corning 3603 Cell Biology grade
ACK lysis buffer Life Technologies A10492 Molecular Biology grade
Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle Thermofisher Scientific Z23373 Molecular Biology grade
C5 deficient serum  Sigma-Aldrich C1163 Biochemical reagent
Centrifuge Labnet International C0160-R
Cytospin 4 Cytocentrifuge Thermofisher Scientific A78300101 Issue 11
DMEM Cell Culture Media Gibco 11995-065 Cell Biology grade
FBS Atlanta Biologicals S11550 Cell Biology grade
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCalibur
Flow Jo Software FlowJo, LLC
Forceps Dumont 0508-SS/45-PS-1 Suitable for laboratory animal dissection
FITC-carboxylated latex beads Sigma-Aldrich L4530 Cell Biology grade
GFP-P. aeruginosa ATCC 101045GFP Suitable for  cell infection assays
Glass bottom dish MatTek Corp. P35G-0.170-14-C Cell Biology grade
High-Pressure Syringe Penn-Century FMJ-250 Suitable for laboratory animal use
Homogenizer Omni International TH-01
Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich H1009 Analytical grade
Inverted Fluorescence Microscope Olympus IX73
Ketamine Hydrochloride Hospira CA-2904 Pharmaceutical grade
Shandon Kwik-Diff Stains Thermofisher Scientific 9990700 Cell Biology grade
LB Agar Fisher Scientific BP1425 Molecular Biology grade
LB Broth Fisher Scientific BP1427 Molecular Biology grade
MicroSprayer Aerosolizer Penn-Century IA-1C Suitable for laboratory animal use
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Reagent grade
PBS Gibco 20012-027 Cell Biology grade
rabbit anti-SRBC-IgG  MP Biomedicals 55806 Suitable for immuno-assays
rabbit anti-SRBC-IgM  Cedarline Laboratories CL9000-M Suitable for immuno-assays
Scissors Miltex 5-2 Suitable for laboratory animal dissection
Small Animal Laryngoscope Penn-Century LS-2 Suitable for laboratory animal use
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) BioRad 1610301 Analytical grade
Spring Scissors (Med) Fine Science Tools 15012-12 Suitable for laboratory animal dissection
Spring Scissors (Small) Fine Science Tools 91500-09 Suitable for laboratory animal dissection
sheep red blood cells (SRBCs)  MP Biomedicals 55876 Washed, preserved SRBCs
Urea Sigma-Aldrich U5378 Molecular Biology grade
Xylazine  Akorn Animal Health 59399-110-20 Pharmaceutical grade

Referências

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Citar este artigo
Nagre, N., Cong, X., Pearson, A. C., Zhao, X. Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice. J. Vis. Exp. (145), e59088, doi:10.3791/59088 (2019).

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