केनोरहब्डिटिस एलीगेंस की स्वचालित phenotypic रूपरेखा द्वारा रासायनिक विषाक्तता की भविष्यवाणी के लिए एक उच्च थ्रूपुट परख
Summary
एक मात्रात्मक विधि की पहचान करने के लिए और रसायनों की तीव्र विषाक्तता स्वचालित रूप से केनोरहब्डिटिस एलिगेंसकी लक्षणप्ररूपी रूपरेखा का विश्लेषण द्वारा विकसित किया गया है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे एक ३८४-well थाली में रसायनों के साथ कीड़े के इलाज के लिए, वीडियो पर कब्जा है, और विषाक्तता संबंधित phenotypes यों तो ।
Abstract
इस तरह के चूहों या चूहों के रूप में उच्च क्रम जीवों में रसायनों का विषाक्तता परीक्षण लागू करने, समय लेने वाली और महंगी है, उनकी लंबी उम्र और रखरखाव के मुद्दों के कारण. इसके विपरीत, सूत्रकृमि केनोराहैब्डिटिस एलीगेंस (सी. एलिगेंस) को यह विषाक्तता परीक्षण के लिए एक आदर्श विकल्प बनाने के लिए फायदे हैं: एक छोटी उम्र, आसान खेती, और कुशल प्रजनन । यहां, हम एक ३८४ में सी एलिगेंस की स्वत: लक्षणप्ररूपी रूपरेखा के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन-अच्छी तरह से थाली । सूत्रकृमि कीड़े तरल माध्यम और रासायनिक उपचार के साथ एक ३८४-वेल प्लेट में सुसंस्कृत हैं, और वीडियो एक अच्छी तरह से ३३ कृमि सुविधाओं पर रासायनिक प्रभाव यों तो करने के लिए ले रहे हैं । प्रयोगात्मक परिणाम दर्शाते हैं कि मात्रा निर्धारित phenotype सुविधाएँ वर्गीकृत कर सकते हैं और विभिन्न रासायनिक यौगिकों के लिए तीव्र विषाक्तता की भविष्यवाणी और एक कृंतक मॉडल में आगे पारंपरिक रासायनिक विषाक्तता मूल्यांकन परीक्षणों के लिए एक प्राथमिकता सूची स्थापित.
Introduction
औद्योगिक उत्पादन और लोगों के दैनिक जीवन के लिए लागू रासायनिक यौगिकों के तेजी से विकास के साथ-साथ, यह रसायनों के लिए विषाक्तता परीक्षण मॉडल का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है. कई मामलों में, रोडेंट पशु मॉडल स्वास्थ्य पर विभिन्न रसायनों की संभावित विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए नियोजित है. सामान्य तौर पर, घातक सांद्रता का निर्धारण (यानी, विभिन्न रसायनों के असायद ५०% घातक खुराक [LD50]) को विवो में पारंपरिक पैरामीटर के रूप में इस्तेमाल किया जाता है, जो कि समय लेने वाला और बहुत महंगा है । इसके अलावा, के कारण कम, परिष्कृत, या (3r) सिद्धांत है कि पशु कल्याण और नैतिकता के लिए केंद्रीय है की जगह, नए तरीकों कि उच्च पशुओं के प्रतिस्थापन के लिए अनुमति वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए मूल्यवान है1,2,3 . C. एलिगेंस एक मुक्त रहने वाले सूत्रकृमि है कि मिट्टी से अलग किया गया है. यह व्यापक रूप से अपनी लाभकारी विशेषताओं की वजह से प्रयोगशाला में एक अनुसंधान जीव के रूप में इस्तेमाल किया गया है, जैसे एक छोटी उम्र, आसान खेती, और कुशल प्रजनन. इसके अलावा, सी. एलिगेंस में बुनियादी शारीरिक प्रक्रियाओं और तनाव प्रतिक्रियाओं सहित कई मौलिक जैविक रास्ते, उच्च स्तनधारियों में संरक्षित हैं4,5,6,7 , 8. तुलना के एक जोड़े में हम और दूसरों को बनाया है, वहां C. एलिगेंस विषाक्तता और विषाक्तता में मनाया के बीच एक अच्छा क़बूल है9कृंतकों । इस सब के सब है C. एलिगेंस एक अच्छा मॉडल vivo में रासायनिक toxicities के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए ।
हाल ही में, कुछ अध्ययनों सी एलिगेंसकी लक्षणप्ररूपी सुविधाओं मात्रा निर्धारित. सुविधाओं का उपयोग रसायनों के विषाक् ताओं का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है2,3,10 और कीड़े की उम्र11. हम यह भी एक तरीका है कि एक तरल कीड़ा संवर्धन प्रणाली और एक छवि विश्लेषण प्रणाली है, जिसमें कीड़े एक ३८४ में सुसंस्कृत अलग रासायनिक उपचार12के तहत अच्छी तरह से तैयार कर रहे है को जोड़ती है विकसित की है । यह मात्रात्मक तकनीक स्वचालित रूप से तरल माध्यम के साथ एक ३८४-अच्छी थाली में रासायनिक उपचार के 12-24h के बाद C. एलिगेंस के ३३ मापदंडों का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया गया है । एक स्वचालित माइक्रोस्कोप चरण प्रयोगात्मक वीडियो अधिग्रहण के लिए प्रयोग किया जाता है । वीडियो एक कस्टम डिजाइन कार्यक्रम द्वारा संसाधित कर रहे हैं, और ३३ ‘ कीड़े चलती व्यवहार से संबंधित सुविधाओं quantified हैं । विधि 10 यौगिकों के उपचार के तहत कृमि phenotypes यों तो करने के लिए प्रयोग किया जाता है । परिणाम बताते है कि विभिंन toxicities सी एलिगेंसके phenotypes बदल सकते हैं । इन मात्रा निर्धारित phenotypes की पहचान करने और विभिन्न रासायनिक यौगिकों की तीव्र विषाक्तता की भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता. इस विधि का समग्र लक्ष्य एक तरल संस्कृति में C. एलिगेंस के साथ प्रयोगों के अवलोकन और लक्षणप्ररूपी प्रमाणन की सुविधा के लिए है. यह विधि रासायनिक विषाक्तता मूल्यांकन और phenotype क्वांटीकरण में सी. एलिगेंस के आवेदन के लिए उपयोगी है, जो विभिन्न रासायनिक यौगिकों की तीव्र विषाक्तता की भविष्यवाणी करने और आगे के पारंपरिक के लिए एक प्राथमिकता सूची स्थापित करने में मदद करता है रासायनिक विषाक्तता एक कृंतक मॉडल में मूल्यांकन परीक्षण । इसके अलावा, इस विधि विषाक्तता स्क्रीनिंग और नए रसायनों या खाद्य additive एजेंट प्रदूषण के रूप में यौगिक का परीक्षण करने के लिए लागू किया जा सकता है, फार्माऑक्सीटिकल यौगिकों, पर्यावरण exogenous यौगिक, और इतने पर.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. एलिगेंस के फायदे9विष विज्ञान में अपनी बढ़ती उपयोग करने के लिए नेतृत्व किया है, दोनों यंत्रवत अध्ययन और उच्च throughput स्क्रीनिंग दृष्टिकोण के लिए. विष विज्ञान अनुसंधान में अन्य मॉडल प्रणालियो…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक कृपया C. elegans भेजने के लिए cgc धंयवाद । यह काम चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705) द्वारा समर्थित था; चीन अनुदान की राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (#31401025, #81273108, #81641184), राजधानी स्वास्थ्य अनुसंधान और बीजिंग में विशेष परियोजना के विकास (#2011-1013-03), पर्यावरण विष विज्ञान की बीजिंग कुंजी प्रयोगशाला के उद्घाटन कोष (# 2015hjdl03), और शांदोंग प्रांत, चीन (ZR2017BF041) के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन ।
Materials
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 59300 | |
| 384-well plates | Throme | 142761 | |
| Agar | Bacto | 214010 | |
| Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | PHL80892 | |
| Bleach buffer | 0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water | ||
| Cadmium chloride | Sigma-Aldrich | 202908 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 21074 | |
| CCD camera | Zeiss | AxioCam HRm | Zeiss microscopy GmbH |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma-Aldrich | 451657 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 24105 | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| K-Medium | 3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water | ||
| LB Broth | 10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| NGM Plate | 3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer | ||
| Peptone | Bacto | 211677 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 60130 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 795496 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| PPB buffer | 35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water | ||
| shaker | ZHICHENG | ZWY-200D | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | s7920 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71690 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 239305 | |
| The link of program | https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate | ||
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | |
| Zeiss automatic microscope | Zeiss | AXIO Observer.Z1 | Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera |
Referências
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