וזמינותו תפוקה גבוהה עבור חיזוי של רעילות כימית על ידי אוטומטית פרופילים פנוטיפי של Caenorhabditis elegans
Summary
שיטה כמותית פותחה כדי לזהות ולחזות את רעילות חריפה של כימיקלים על-ידי ניתוח באופן אוטומטי את פרופיל פנוטיפי של Caenorhabditis elegans. פרוטוקול זה מתאר כיצד להתייחס תולעים עם כימיקלים בצלחת 384-ובכן, לכידת וידאו, לכמת פנוטיפים קשורים רעילות.
Abstract
החלת בדיקות רעילות של כימיקלים עילאיים הסדר, כגון עכברים או חולדות, היא גוזלת זמן יקר, בשל תוחלת החיים הארוכה שלהם בעיות תחזוקה. להיפך, תולעים נימיות Caenorhabditis elegans (C. elegans) יש יתרונות כדי שזה הבחירה האידיאלית לבדיקת רעילות: אורך קצר, טיפוח קל, יעיל רבייה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור אוטומטית פנוטיפי בניית פרופיל של C. elegans בצלחת 384-. טוב. תולעים נמטודות בתרבית בצלחת 384-טוב עם טיפול כימי ובינוניות נוזלי, קטעי וידאו נלקחים כל הבאר כדי לכמת את ההשפעה הכימית על תכונות תולעת 33. תוצאות ניסויית מדגימים כי התכונות פנוטיפ כימות ניתן לסווג לחזות רעילות חריפה על תרכובות כימיות שונות, ליצור רשימה עדיפות לבדיקות רעילות כימית מסורתי הערכת במודל של מכרסמים.
Introduction
עם התפתחות מהירה של תרכובות כימיות שהוחלה על הייצור התעשייתי ועל חיי היומיום של אנשים, חשוב ללמוד רעילות בדיקת מודלים כימיקלים. במקרים רבים, המודל החייתי מכרסמים הוא מועסק כדי להעריך את פוטנציאל רעילות של כימיקלים שונים על הבריאות. באופן כללי, הקביעה של ריכוזים קטלני (קרי, assayed 50% מנה קטלנית [LD50] של כימיקלים שונים) משמש כפרמטר מסורתי במודל מכרסם (עכברוש/עכבר) אין ויוו, וזה זמן רב ויקר מאוד. בנוסף, בשל הקטן, לחדד, או להחליף את העיקרון (3R) היא מרכזית בעלי חיים רווחה, אתיקה מקצועית, שיטות חדשות המאפשרות עבור ההחלפה של בעלי חיים גבוהים יותר הם בעלי ערך מחקר מדעי-1,–2,–3 . C. elegans הוא תולעים נימיות אל-אווירני עצמאי אשר היה מבודד מן הקרקע. זה כבר בשימוש נרחב כאורגניזם מחקר במעבדה בשל מאפייניו מועילים, כגון אורך קצר, טיפוח קל, יעיל רבייה. בנוסף, הרבה מסלולים ביולוגיים בסיסיים, כולל תהליכים פיזיולוגיים בסיסיים ותגובות הלחץ ב- C. elegans, נשמרים ב-6,5,4,יונקים גבוהה יותר7 , 8. כמה השוואות אנחנו ואחרים עשו, יש הקונקורדנציה טוב בין C. elegans רעילות רעילות שנצפתה מכרסמים9. כל זה הופך את C. elegans מודל טוב כדי לבדוק את השפעות רעילות כימית ויוו.
לאחרונה, מחקרים לכמת את התכונות פנוטיפי של C. elegans. התכונות ניתן לנתח את רעילות של כימיקלים2,3,10 , הזדקנות תולעים11. גם פיתחנו שיטה המשלבת תולעת נוזלי culturing מערכת, מערכת ניתוח התמונה, שבה התולעים הם בתרבית בצלחת 384-ובכן תחת טיפולים כימיים שונים12. טכניקה זו כמותיים פותחה לנתח באופן אוטומטי את הפרמטרים 33 של C. elegans לאחר 12-24 שעות של טיפול כימי בצלחת 384-ובכן עם המדיום הנוזלי. שלב במיקרוסקופ אוטומטי משמש עבור רכישת וידאו ניסיוני. קטעי וידאו מעובדות על-ידי תוכנית אישית מעוצבת, 33 תכונות הקשורות להתנהגות נע של התולעים הם לכמת. השיטה משמשת כדי לכמת את התולעת פנוטיפים תחת הטיפול של תרכובות 10. התוצאות מציגות כי רעילות שונים יכולים לשנות על הפנוטיפים של C. elegans. אלה פנוטיפים כימות יכול לשמש כדי לזהות ולחזות רעילות חריפה של תרכובות כימיות שונות. המטרה הכוללת של שיטה זו היא להקל על תצפיות ועל כימות פנוטיפי של ניסויים עם C. elegans בתרבות נוזלי. שיטה זו שימושית עבור היישום של C. elegans הערכות רעילות כימית, פנוטיפ quantifications, אשר מסייעים לחזות רעילות חריפה של תרכובות כימיות שונות וליצור רשימת סדר העדיפויות עבור עוד יותר מסורתי בדיקות הערכת כמות רעילה במודל של מכרסמים. בנוסף, שיטה זו ניתן ליישם רעילות הקרנת ובדיקות של כימיקלים חדשים או המתחם ‘ זיהום הסוכן כתוסף מזון, תרכובות pharmacautical, סביבה אקסוגניים המתחם, וכן הלאה.
Protocol
Representative Results
Discussion
היתרונות של C. elegans הובילו השימוש הגובר הרעלים9, הן עבור מחקרים מכניסטית וגישות ההקרנה תפוקה גבוהה. תפקיד מוגבר עבור C. elegans משלימים למערכות אחרות דגם במחקר רעילות הינו יוצא דופן בשנים האחרונות, במיוחד להערכה מהירה רעילות של כימיקלים חדשים. מאמר זה מספק וזמינותו החדש ש?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים CGC על מתבקשים לשלוח את C. elegans. עבודה זו נתמכה על ידי מפתח הלאומית למחקר פיתוח תוכנית של סין (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705); קרן מדעי הטבע הלאומית של סין גרנט (#31401025, #81273108 #81641184), בריאות ההון מחקר ופיתוח של פרויקט מיוחד בבייג’ינג (#2011-1013-03), הקרן הפתיחה של בייג’ינג המעבדה מפתח של טוקסיקולוגיה סביבתית (# 2015HJDL03), בסיס מדעי הטבע מחוז שאנדונג, סין (ZR2017BF041).
Materials
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 59300 | |
| 384-well plates | Throme | 142761 | |
| Agar | Bacto | 214010 | |
| Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | PHL80892 | |
| Bleach buffer | 0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water | ||
| Cadmium chloride | Sigma-Aldrich | 202908 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 21074 | |
| CCD camera | Zeiss | AxioCam HRm | Zeiss microscopy GmbH |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma-Aldrich | 451657 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 24105 | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| K-Medium | 3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water | ||
| LB Broth | 10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| NGM Plate | 3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer | ||
| Peptone | Bacto | 211677 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 60130 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 795496 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| PPB buffer | 35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water | ||
| shaker | ZHICHENG | ZWY-200D | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | s7920 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71690 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 239305 | |
| The link of program | https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate | ||
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | |
| Zeiss automatic microscope | Zeiss | AXIO Observer.Z1 | Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera |
Referências
- Anderson, G. L., et al. Assessing behavioral toxicity with Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 23 (5), 1235-1240 (2004).
- Boyd, W. A., et al. A high-throughput method for assessing chemical toxicity using a Caenorhabditis elegans reproduction assay. Toxicology and Applied Pharmacology. 245 (2), 153-159 (2010).
- Boyd, W. A., Williams, P. L. Comparison of the sensitivity of three nematode species to copper and their utility in aquatic and soil toxicity tests. Environmental Toxicology and Chemistry. 22 (11), 2768-2774 (2003).
- Dengg, M., van Meel, J. C. Caenorhabditis elegans as model system for rapid toxicity assessment of pharmaceutical compounds. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (3), 209-214 (2004).
- Schouest, K., et al. Toxicological assessment of chemicals using Caenorhabditis elegans and optical oxygen respirometry. Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (4), 791-799 (2009).
- Sprando, R. L., et al. A method to rank order water soluble compounds according to their toxicity using Caenorhabditis elegans, a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter, and axenic liquid media. Food and Chemical Toxicology. 47 (4), 722-728 (2009).
- Wang, D., Xing, X. Assessment of locomotion behavioral defects induced by acute toxicity from heavy metal exposure in nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Environmental Sciences (China). 20 (9), 1132-1137 (2008).
- Leung, M. C., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences. 106 (1), 5-28 (2008).
- Li, Y., et al. Correlation of chemical acute toxicity between the nematode and the rodent. Toxicology Research. 2 (6), 403-412 (2013).
- Boyd, W. A., et al. Effects of genetic mutations and chemical exposures on Caenorhabditis elegans feeding: evaluation of a novel, high-throughput screening assay. PLoS One. 2 (12), 1259 (2007).
- Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
- Gao, S., et al. Classification and prediction of toxicity of chemicals using an automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. BMC Pharmacology and Toxicology. 19 (1), 18 (2018).
- Moyson, S., et al. Mixture effects of copper, cadmium, and zinc on mortality and behavior of Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (1), 145-159 (2018).
- Wang, X., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by DMSO is dependent on sir-2.1 and daf-16. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (4), 613-618 (2010).
- Boyd, W. A., et al. Developmental Effect of the ToxCast Phase I and Phase II Chemicals in Caenorhabditis elegans and Corresponding Responses in Zebrafish, Rats, and Rabbits. Environmental Health Perspectives. 124 (5), 586-593 (2016).
