En kvantitativ metode er blevet udviklet for at identificere og forudse kemikalier akutte toksicitet af automatisk analysere fænotypiske profilering af Caenorhabditis elegans. Denne protokol beskriver, hvordan du behandler orme med kemikalier i en 384-godt plade, fange videoer og kvantificere toksikologiske relaterede fænotyper.
Anvendelse af toksicitetstest af kemikalier i højere orden organismer, såsom mus eller rotter, er tidskrævende og dyrt, på grund af deres lange levetid og vedligeholdelse problemer. Tværtimod nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) har fordele ved at gøre det et ideelt valg for afprøvning af toksicitet: en kort levetid, nem dyrkning og effektiv reproduktion. Her, beskriver vi en protokol for den automatiske fænotypiske profilering af C. elegans i en 384-godt plade. Ødelægge orme er kulturperler i en 384-godt plade med flydende medium og kemisk behandling, og videoer er taget af hver brønd til at kvantificere de kemiske indflydelse på 33 orm funktioner. Eksperimentelle resultater viser, at de kvantificerede fænotype funktioner kan klassificere og forudsige den akutte toksicitet for forskellige kemiske stoffer og fastsætte en prioriteringsliste for yderligere traditionelle kemiske toksicitet bedømmelse test i en gnaver model.
Sammen med den hurtige udvikling af kemiske forbindelser anvendes til industriel produktion og folks daglige liv, er det vigtigt at undersøge toksicitet test modeller for kemikalier. I mange tilfælde, er de gnaver dyremodel ansat til at evaluere den potentielle toksicitet af forskellige kemikalier på sundhed. Bestemmelse af dødbringende koncentrationer (dvs. den analyserede 50% dødelig dosis [LD50] forskellige kemikalier) bruges generelt, som de traditionelle parameter i en gnaver (rotte/mus) model in vivo, som er tidskrævende og meget dyrt. Hertil kommer, på grund af Reducer, forfine, eller erstatte (3R) princippet, der er centrale for dyrevelfærd og etik, nye metoder, som giver mulighed for udskiftning af højere dyr er værdifulde for videnskabelig forskning1,2,3 . C. elegans er en fritlevende nematode, der har været isoleret fra jord. Det har været almindeligt anvendt som en forskning organisme i laboratoriet på grund af dets gavnlige egenskaber, såsom en kort levetid, nem dyrkning og effektiv reproduktion. Derudover er mange grundlæggende biologiske veje, herunder grundlæggende fysiologiske processer og stress reaktioner i C. elegans, bevaret i større pattedyr4,5,6,7 , 8. i et par af sammenligninger vi og andre har gjort, er der en god overensstemmelse mellem C. elegans toksicitet og toksicitet observeret i gnavere9. Alt dette gør C. elegans en god model til at teste effekten af kemiske toksicitet in vivo.
For nylig, nogle undersøgelser kvantificeres de fænotypiske egenskaber i C. elegans. Funktionerne kan bruges til at analysere toksicitet af kemikalier2,3,10 og ældning af orme11. Vi har også udviklet en metode, der kombinerer en flydende orm dyrkning system og et billede analysesystem, hvor ormene er kulturperler i en 384-godt plade under forskellige kemiske behandlinger12. Denne kvantitative teknik er udviklet til at automatisk analysere de 33 parametre af C. elegans efter 12-24h af kemisk behandling i en 384-godt plade med flydende medium. En automatiseret mikroskop fase bruges til eksperimenterende video erhvervelse. Videoerne er behandlet af en custom-designet program, og 33 funktioner med relation til orme bevægelige adfærd er kvantificeret. Metoden bruges til at kvantificere orm fænotyper under behandlingen af 10 forbindelser. Resultaterne viser, at forskellige toksicitet kan ændre fænotyper af C. elegans. Disse kvantificerede fænotyper kan bruges til at identificere og forudsige forskellige kemiske stoffer akutte toksicitet. Det overordnede mål med denne metode er at lette observation og fænotypiske kvantificering af eksperimenter med C. elegans i en flydende kultur. Denne metode er nyttig til anvendelse af C. elegans i kemiske toksicitet evalueringer og fænotype kvantificeringer, der hjælpe med at forudsige den akutte toksicitet af forskellige kemiske stoffer og fastsætte en prioriteringsliste for yderligere traditionelle kemiske toksicitet bedømmelse test i en gnaver model. Derudover kan denne metode anvendes til toksicitet screening og testning af nye kemikalier eller sammensat som food additive agent forurening, pharmacautical forbindelser, miljømæssige eksogene sammensatte og så videre.
Fordelene ved C. elegans har ført til den øgede brug i toksikologi9, både for Mekanistiske undersøgelser og høj overførselshastighed screening tilgange. En øget rolle for C. elegans i supplerer andre modelsystemer i toksikologiske forskning har været bemærkelsesværdig i de seneste år, især for den hurtige toksicitet vurdering af nye kemikalier. Denne artikel giver en ny analyse af høj overførselshastighed, kvantitativ screening af ormen fænotyper i en 384-godt plad…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke CGC til venligst at sende C. elegans. Dette arbejde blev støttet af nationale nøglen forskning og udvikling Program af Kina (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705); National Natural Science Foundation i Kina Grant (#31401025, #81273108, #81641184), hovedstaden sundhedsforskning og udvikling af særlige projekt i Beijing (#2011-1013-03), fondens åbningen af Beijing centrale laboratorium af miljømæssige toksikologi (# 2015HJDL03), og Natural Science Foundation i Shandong-provinsen, Kina (ZR2017BF041).
2-Propanol | Sigma-Aldrich | 59300 | |
384-well plates | Throme | 142761 | |
Agar | Bacto | 214010 | |
Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | PHL80892 | |
Bleach buffer | 0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water | ||
Cadmium chloride | Sigma-Aldrich | 202908 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 21074 | |
CCD camera | Zeiss | AxioCam HRm | Zeiss microscopy GmbH |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
Copper(II) sulfate | Sigma-Aldrich | 451657 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 24105 | |
Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
K-Medium | 3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water | ||
LB Broth | 10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl | ||
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 63140 | |
NGM Plate | 3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer | ||
Peptone | Bacto | 211677 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 60130 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 795496 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 795488 | |
PPB buffer | 35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water | ||
shaker | ZHICHENG | ZWY-200D | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | |
Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | s7920 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71690 | |
Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 239305 | |
The link of program | https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate | ||
Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | |
Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | |
Zeiss automatic microscope | Zeiss | AXIO Observer.Z1 | Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera |