बहुरंगा प्रवाह Cytometry-टी कोशिकाओं में Mitochondria और Lysosomes के ठहराव आधारित
Summary
यह लेख एक शक्तिशाली विधि mitochondria या lysosomes यों में रहने वाली कोशिकाओं को समझाती है । lysosome के संयोजन-या mitochondria-सतह मार्करों के खिलाफ फ्लोरोसेंट संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ विशिष्ट रंजक मिश्रित कोशिका आबादी में इन organelles के ठहराव, प्राथमिक ऊतक नमूनों से काटा कोशिकाओं की तरह, की अनुमति देता है का उपयोग करके बहुरंगा प्रवाह cytometry.
Abstract
Introduction
सक्रियकरण और टी कोशिकाओं के प्रसार सफल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं बढ़ते के लिए महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं । हाल के अग्रिम सुझाव है कि सेलुलर चयापचय कसकर दोनों विकास और टी कोशिकाओं के कार्यों के साथ जुड़ा हुआ है । उदाहरण के लिए, भोली टी कोशिकाओं माध्यमिक लसीकावत् अंगों के बीच संचलन के दौरान ऊर्जा की मांग को पूरा करने के लिए काफी हद तक ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण (OXPHOS) पर भरोसा करते हैं । सक्रियण पर, भोली टी कोशिकाओं को एटीपी उत्पादन बढ़ाने के लिए और सेल भेदभाव और प्रसार के दौरान जबरदस्त चयापचय मांगों को पूरा करने के लिए एरोबिक glycolysis की प्रेरण सहित कठोर चयापचय reprogramminging, से गुजरना । कोशिकाओं है कि चयापचय की जरूरत के माध्यम से पालन करने में विफल apoptosis1,2से मर जाते हैं । चयापचय reprogramminging के दौरान, mitochondria महत्वपूर्ण भूमिका निभा के बाद से वे organelles के उत्पादन के लिए मोटे तौर पर जिंमेदार है सेल के लिए ऊर्जा की आपूर्ति, और सेलुलर mitochondria सामग्री चयापचय स्विच के दौरान उतार चढ़ाव टी सेल विकास और सक्रियकरण3भर में । हालांकि, अनावश्यक या क्षतिग्रस्त mitochondria के संचय अतिरिक्त ROS उत्पादन कर सकते है कि लिपिड नुकसान, प्रोटीन, और डीएनए, और अंततः कोशिका मृत्यु4 के लिए नेतृत्व कर सकते है
अत्यधिक या क्षतिग्रस्त mitochondria चयापचय परिवर्तन से उत्पंन autophagy5, mitophagy के रूप में जाना के एक विशेष रूप से हटा रहे हैं । Mitochondria autophagosomes से लिपटे हुए हैं और फिर क्षरण के लिए lysosomes के साथ जुड़े हुए हैं । mitochondria और lysosomes के बीच इन बंद संचार महान ब्याज6,7उत्पंन किया है । उदाहरण के लिए, ऑक्सीडेटिव तनाव mitochondria mitochondria-व्युत्पन्न बुलबुले (MDVs) है कि एक lysosomes और फॉस्फेट tensin (homolog)-प्रेरित PTEN ख्यात 1 (कळेनासे) और PINK1 (एक E3 parkin ubiquitin) में क्षरण के लिए ligase करने के लिए लक्षित कर रहे हैं फार्म करने के लिए उत्तेजित करता है आश्रित रीति8. यह भी पाया गया कि mitophagy बेज रंग के लिए सफेद adipocyte संक्रमण9,10के लिए आवश्यक है । इससे भी अहम बात यह है कि lysosomes महज एक गिरावट वाले डिब्बे नहीं हैं, बल्कि सेल्यूलर सिग्नलिंग का एक रेगुलेटर है । अत्यधिक सब्सट्रेट संचय lysosomal झिल्ली पारगम्यता को बाधित करने के द्वारा lysosomal रोग में एंजाइम की कमी के परिणाम के कारण और प्रभावित करता है Ca2 + homeostasis11. टी सेल कार्यात्मक दोष में lysosomal एसिड lipase (लाल)12 या lysosomal metabolite ट्रांसपोर्टर नॉकआउट माउस मॉडल13 आगे टी सेल lysosomes को बनाए रखने में homeostasis के महत्व को दिखाया । दोनों mitochondria और lysosomes सेलुलर चयापचय विनियमन के अविभाज्य भागों हैं । इसलिए, सेलुलर mitochondrial सामग्री की माप टी सेल चयापचय और कार्यात्मक स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए एक महत्वपूर्ण संकेतक किया गया है.
परख सामांयतः सेलुलर mitochondrial या lysosomal सामग्री के लिए इस्तेमाल किया immunoblot शामिल हैं, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, immunofluorescent (यदि) धुंधला, और पीसीआर mitochondrial डीएनए की नकल संख्या14,15, 16. जबकि immunoblot मात्रा अलग नमूनों और इलेक्ट्रॉन भर में प्रोटीन के स्तर की तुलना कर सकते है या अगर माइक्रोस्कोपी इन organelles17की रूपात्मक बानगी कल्पना कर सकते हैं, इन परख कुछ तकनीकी कमियां सहन । उदाहरण के लिए, यह उच्च आवर्धन और संकल्प के साथ सेल छवियों की पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के लिए या नमूने के दर्जनों भर में एक प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना करने के लिए समय लेने वाली है, इन परख कम प्रवाह तरीकों माना जाता है । इसके अलावा, इन परख केवल सेल लाइनों के रूप में समरूप सेल जनसंख्या, के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन नहीं ऊतक नमूने है कि मिश्रित आबादी से बना रहे हैं ।
यह दुर्लभ आबादी के लिए इन परख लागू करने के लिए भी मुश्किल है, जिसके लिए 106 से 108 से ंयूनतम सेल संख्या की आवश्यकता को पूरा करने के लिए असंभव है । अंत में, कोशिकाओं को आमतौर पर लीजड ड या प्रक्रिया के दौरान तय कर रहे हैं, उंहें अंय तरीकों के साथ असंगत बनाने के लिए और अधिक जानकारी निकालने । पारंपरिक तरीकों के साथ तुलना में, फ्लोरोसेंट आधारित प्रवाह cytometry एक अपेक्षाकृत उच्च प्रवाह है-एक मिश्रित कोशिका आबादी से बना नमूना के भीतर सभी कोशिकाओं की जानकारी का विश्लेषण किया जा सकता है और एक साथ एकत्र । इसके अलावा, एक ही सेल पर 10 से अधिक मापदंडों का पता लगाने और आगे की परख के लिए वांछित phenotypes के आधार पर कोशिकाओं को सॉर्ट कर सकते हैं । प्रतिक्रियाशील फ्लोरोसेंट जांच जीवित कोशिकाओं में lysosomes और mitochondria लेबल और प्रवाह18,19cytometry द्वारा पता लगाया जा सकता है इस्तेमाल किया गया है । इन organelle-विशिष्ट जांच सेल पारगंय है और फिजिको-रासायनिक विशेषताओं है कि उंहें विशिष्ट उपसेलुलर स्थानों या organelles में केंद्रित होने की अनुमति है । आसानी से, इन जांच विभिंन फ्लोरोसेंट प्रारूपों में उपलब्ध हैं, इस प्रकार बहुरंगा विश्लेषण के लिए अपने आवेदन को सक्षम करने ।
यह प्रोटोकॉल विस्तार में वर्णन करता है कि कैसे lysosome-या mitochondria-विशिष्ट रंजक के साथ सतह मार्कर दाग गठबंधन करने के लिए lysosomes या जीवित कोशिकाओं में mitochondria लेबल । यह प्राथमिक ऊतकों और अंगों, जो अक्सर विषम कोशिका आबादी से बना रहे हैं से उत्पन्न नमूनों के लिए विशेष रूप से उपयोगी है. शोधकर्ताओं ने अपनी सतह मार्कर अभिव्यक्ति द्वारा ब्याज की कोशिका आबादी की पहचान और विशेष रूप से इन कोशिकाओं में organelle-विशिष्ट रंगों के माध्यम से lysosomal या mitochondrial सामग्री को मापने कर सकते हैं । यहाँ, हम प्रमुख प्लीहा टी सेल उपआबादी में lysosomal या mitochondrial मास का मूल्यांकन करता है कि प्रवाह cytometric विश्लेषण की विस्तृत प्रक्रिया का प्रदर्शन.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल organelle विशिष्ट रंजक और सतह मार्कर दाग को जोड़ती है mitochondria या lysosomes की राशि अलग टी कोशिका आबादी में मात्रा । इस विधि के लिए सेल संख्या और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और immunoblot विश्लेषण के रूप में पारंपर…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस प्रोटोकॉल के विकास के लिए ताइवान विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय से अनुदान का समर्थन किया गया था (अधिकांश) NSC103-उंचीवर-b-010-002-MY2 and MOST104-2628-b-010-002-MY4 ते टिपू सू. C.W. वेई संस्थान के माइक्रोबायोलॉजी और इम्यूनोलॉजी, राष्ट्रीय यांग-मिंग विश्वविद्यालय के उत्कृष्ट थीसिस पुरस्कार के एक प्राप्तकर्ता है ।
Materials
| 10 cm Graefe forceps (straight and serrated) | Dimeda | ||
| 11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads) | Dimeda | ||
| 15 mL centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| 5 mL syringe | TERUMO | ||
| 6 cm Petri dish | α-plus | ||
| 70 µm nylon cell strainer | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma | A9434 | |
| Anti-mouse CD25 | Biolegend | 102007 | Clone:PC61 |
| Anti-mouse CD4 | Biolegend | 100453 | Clone:GK1.5 |
| Anti-mouse CD44 | Biolegend | 103029 | Clone:IM7 |
| Anti-mouse CD62L | Biolegend | 104407 | Clone:MEL-14 |
| Anti-mouse CD8 | Biolegend | 100713 | Clone:53-6.7 |
| Anti-mouse TCRβ | Biolegend | 109233 | Clone:H57-579 |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio basic | 6381-92-6 | |
| FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube) | BD Biosciences | 352052 | |
| FcRgamma II (CD32) Hybridoma (2.4G2) | ATCC | HB-197 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | ATD161145 | |
| Flowjo, LLC | BD Biosciences | ||
| Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H4034 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| LysoTracker Green DND26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| MEM Non-essential amino acids (100X) | Gibco | 11140050 | |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | J.T.baker | 298-14-6 | |
| Propidium iodide solution | Sigma | 25535-16-4 | |
| RPMI 1640 medium (powder) | Gibco | 31800089 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 |
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