Quantificação de baseados em citometria de fluxo multicolor de mitocôndrias e lisossomos em células T

A ativação e proliferação de células T são passos críticos para a montagem de sucesso respostas imunes. Avanços recentes sugerem que o metabolismo celular é fortemente associado com o desenvolvimento e as funções das células T. Por exemplo, ingênuo T células dependem em grande parte a fosforilação oxidativa (OXPHOS) para atender a demanda de energia durante a recirculação entre os órgãos linfoides secundários. Após a ativação, ingênuo T células passam por drásticas reprogramação metabólica, incluindo a indução da glicólise aeróbica para aumentar a produção de ATP e para atender as demandas metabólicas tremenda durante a proliferação e diferenciação celular. As células que não conseguem cumprir as necessidades metabólicas morrem por apoptose^1,2. Durante a reprogramação metabólica, mitocôndrias desempenham papéis importantes, uma vez que eles são as organelas em grande parte responsáveis pela produção de ATP para fornecer energia para a célula, e o conteúdo de mitocôndrias celulares flutua durante switches metabólicas em toda a célula T desenvolvimento e ativação³. No entanto, o acúmulo de mitocôndrias supérfluos ou danificadas pode produzir excesso ROS que danificam lipídeos, proteínas e DNA e pode eventualmente levar a célula a morte⁴

As mitocôndrias excessivas ou danos resultantes de alterações metabólicas são removidas por uma forma especializada de autofagia⁵, conhecido como mitophagy. Mitocôndrias são delimitadas por autophagosomes e então fundidas com lisossomos para degradação. Estas fechem as comunicações entre mitocôndrias e lisossomos têm gerado grande interesse^6,7. Por exemplo, o estresse oxidativo estimula mitocôndrias para formar vesículas mitocôndrias-derivado (MDVs) que são alvo de lisossomos para degradação em um homólogo fosfatase e tensin (PTEN)-induzido putativa quinase 1 (PINK1) e Pereira Barbosa (um E3 ubiquitina ligase) dependente da forma⁸. Verificou-se também que mitophagy é essencial para a transição de adipócito branco bege-para^9,10. Mais importante, lisossomos não são meramente um compartimento de degradação, mas também um regulador de sinalização celular. Acumulação excessiva de substrato devido a deficiência enzimática resulta em disfunção dos lisossomos por perturbar a permeabilidade da membrana dos lisossomos e afeta Ca^{2 +} homeostase¹¹. Os defeitos funcionais de células T em lipase ácida lisossômica (LAL)¹² ou metabólito lisossomal transportador nocaute do mouse modelo¹³ revelou ainda a importância de lisossomos na manutenção da homeostase de células T. Tanto as mitocôndrias e lisossomos são partes inseparáveis da regulação metabólica celular. Portanto, a medição de conteúdo mitocondrial celular tem sido um indicador fundamental para avaliar o status de metabólica e funcional de células T.

Ensaios comumente usados para quantificar o conteúdo mitocondrial ou dos lisossomos celular incluem immunoblot, microscopia eletrônica, imunofluorescência (IF) coloração e análise PCR de mitochondrial DNA copiar números^{14,15, 16}. enquanto immunoblot quantitativamente pode comparar níveis de proteína em diferentes amostras e elétron ou se microscopia pode visualizar as características morfológicas destas organelas¹⁷, estes ensaios suportar certas desvantagens técnicas. Por exemplo, é demorado para adquirir um número suficiente de imagens de células com alta ampliação e resolução ou para comparar os níveis de expressão de uma proteína em dezenas de amostras, tornando estes ensaios considerados métodos de baixa taxa de transferência. Além disso, estes ensaios só podem ser aplicados à população da pilha homogénea, tais como linhas de celular, mas não para amostras de tecido que são compostas de populações mistas.

Também é difícil de aplicar estes ensaios para populações raras, para as quais a exigência de mínima célula números de 10⁶ 10⁸ é impossível de encontrar. Finalmente, as células são geralmente lysed ou fixo durante o processo, tornando-os incompatíveis com outros métodos para extrair mais informações. Comparado com os métodos tradicionais, citometria de fluxo fluorescente-based tem um relativamente alto throughput – as informações de todas as células dentro de uma amostra compostas de populações de células mistas podem ser analisadas e coletadas simultaneamente. Além disso, um pode detectar mais de 10 parâmetros na mesma célula e classificar as células com base em fenótipos desejados para mais ensaios. Sondas fluorescentes reativas tem sido usadas para rotular lisossomos e mitocôndrias em células vivas e podem ser detectadas por citometria de fluxo^18,19. Estas sondas específicas das organelas são célula permeável e têm características físico-químicas que lhes permitam concentrar-se em locais específicos subcellular ou organelas. Convenientemente, estes testes estão disponíveis em vários formatos fluorescentes, permitindo assim a sua aplicação para análise multicolor.

Este protocolo descreve em detalhes como combinar o marcador de superfície a coloração com corantes lisossomo mitocôndria-específico ou de lisossomos rótulo ou as mitocôndrias em células vivem. Isso é especialmente útil para amostras geradas a partir de tecidos primários e órgãos, que muitas vezes são compostos de populações de células heterogêneas. Pesquisadores podem identificar populações de células de interesse pela sua expressão do marcador de superfície e medir especificamente o conteúdo dos lisossomos ou mitocondrial através de corantes específicos organela nestas células. Aqui, demonstramos o procedimento detalhado de análise de fluxo cytometric que avalia a massa dos lisossomos ou mitocondrial em subpopulações o major esplênica T cell.