Summary

تحليل البروتين الاستقطاب بلعم البشرية تحت بيئة منخفضة الأكسجين

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

نقدم بروتوكول للحصول على توقيعات البروتين الضامة البشرية وتطبيق هذا على تحديد أثر بيئة منخفضة الأكسجين في الاستقطاب بلعم.

Abstract

الضامة هي الخلايا المناعية الفطرية تشارك في عدد من الوظائف الفسيولوجية التي تتراوح من الردود على مسببات الأمراض المعدية إلى التوازن الأنسجة. وظائف مختلفة من هذه الخلايا تتصل بدولهم التنشيط، الذي يسمى أيضا الاستقطاب. الوصف الجزيئي الدقيق لهذه الاستقطابات المختلفة أولويات في مجال البيولوجيا بلعم. من المسلم به حاليا أن اتباع نهج متعدد الأبعاد ضروري لوصف كيفية التحكم في استقطاب الإشارات البيئية. وفي هذا التقرير، يصف لنا بروتوكول مصمم للحصول على توقيع البروتين استقطابات مختلفة في الضامة البشرية. ويستند هذا البروتوكول إجراء تقييم كمي للتعبير البروتين بلعم الحصول عليها من مجزأ بهلام ومحتوى تحلل الخلوية Lys ج/التربسين-يهضم خالية من التسمية. نحن نقدم أيضا بروتوكول استناداً إلى الهضم بالحل و isoelectric تركز تجزئة لاستخدامه كبديل لذلك. نظراً لأن تركيز الأكسجين معلمة بيئية ذات صلة في الأنسجة، يمكننا استخدام هذا البروتوكول لاستكشاف تركيبة الغلاف الجوي كيف أو بيئة منخفضة أكسجين يؤثر على تصنيف بلعم الاستقطاب.

Introduction

الضامة هي الخلايا المناعية الفطرية تشارك في عدد من الوظائف الفسيولوجية التي تتراوح من الردود على مسببات الأمراض المعدية إلى التوازن الأنسجة، بما في ذلك إزالة الخلايا أبوبتوتيك وتجديد المصفوفة خارج الخلية1. تتميز هذه الخلايا اللدونة المظهرية قوية2 أن يترجم إلى إمكانية تنشيط العديد من دول، التي تسمى أيضا الاستقطابات. الوصف الجزيئي الدقيق لهذه الاستقطابات المختلفة أولويات في مجال علم الأحياء بلعم3. اقترح تصنيف هذه الاستقطابات استخدام ما يسمى الانقسام M1/M2، الذي يمثل M1 برو التحريضية و M2 يمثل الضامة للالتهابات. يناسب هذا النموذج جيدا في مختلف الحالات المرضية مثل الالتهابات الحادة والحساسية والسمنة4. ومع ذلك، في الأنسجة الملتهبة المزمن والسرطان، وقد ثبت أن هذا التصنيف غير قادر على فهم مرجع المظهرية الواسعة التي الضامة الموجودة في بعض البيئات الخلوية5،6، 7-توافق الآراء الحالي أن بلعم الاستقطاب أفضل وصف باستخدام نموذج متعدد الأبعاد لدمج إشارات محددة ميكرونفيرونمينتال8. وقد أكد هذا الاستنتاج من خلال تحليل ترانسكريبتوميك الضامة البشرية تبين أن طراز M1/M2 غير فعال في وصف الاستقطابات حصل على9.

قدمت الدراسة يهدف إلى توفير بروتوكول للحصول على توقيعات البروتين من استقطابات مختلفة في الضامة البشرية. ونحن تصف كيفية التفريق الضامة البشرية في بيئات لمختلف مستويات الأوكسجين والحصول على الببتيدات من البروتين بلعم كاملة القيام بإجراء تقييم كمي خالية من التسمية. ويسمح هذا التحديد الكمي مقارنة مستويات التعبير من البروتينات المختلفة. كما كشفت الأبحاث حول الخلايا الجذعية أهمية الأوكسجين معلمة رئيسية بيئية10، نحن نسعى إلى فهم كيف يمكن أن تؤثر هذه المعلمة الأنسجة بلعم الاستقطاب في البشر. الضغط الجزئي للأكسجين قد وجد أن تتراوح من 3 إلى 20% (من مجموع الضغط الجوي) في جسم الإنسان، حيث يقابل 20% تقريبا لما يستخدم عادة في حاضنة ثقافة خلية (القيمة الصحيحة هي حوالي 18.6 في المائة مع مراعاة وجود الماء في الاعتبار).

وقد أظهرت الأعمال السابقة أن السنخية تختلف عن الضامة فراغي من الوظيفية والمورفولوجية نقطة المشاهدات11 وأن هذه الاختلافات على الأرجح جزئيا نظراً لمستويات مختلفة من الأكسجين التي هي عرضه12. وعلاوة على ذلك، تظهر المشتقة من نخاع العظم الضامة زيادة قدرة على فاجوسيتيزي البكتيريا عند تعرضها ل بيئة منخفضة أكسجين12. تم العثور على تأثير معاكس الضامة البشرية المتباينة THP113، ولكن هذه النتائج تدعم الفكرة القائلة بأن الأكسجين منظم للبيولوجيا بلعم وأن من الضروري توضيح هذا الدور على المستوى الجزيئي في الضامة البشرية. وفي دراسة سابقة، المطبقة لدينا نهج البروتيوميات لمعالجة هذه القضايا. عن طريق قياس مستويات التعبير لآلاف بروتينات في نفس الوقت، سلطت الضوء على تأثير الأكسجين على الاستقطاب، وقدمت قائمة بالمؤشرات الجزيئية الجديدة. تمكنا أيضا من ربط هذه النتائج ببعض وظائف الضامة. جدير بالذكر أن وجدنا أن معدل البلعمه لخلايا apoptotic قد زيدت في الضامة IL4/IL13-الاستقطاب، التي ترتبط ب upregulation ALOX15 كما يتبين من تحليل البروتين14. في هذه الدراسة، ونحن تصف كيفية إجراء هذا تحليل.

Protocol

وتم الحصول على عينات الدم البشري (لرسك) من الجهات المانحة صحية، وإزالة الألغام التي تم تحديدها من EFS (خدمة الدم الوطنية الفرنسية) كجزء من وضع بروتوكول معتمد (DC كوديكوه-2018-3114). وقدم المانحون موافقة موقعة لاستخدام الدم. 1-وسائل الإعلام وإعداد المخزن المؤقت إعداد متوسطة بلع?…

Representative Results

بدءاً من خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس) التي تم الحصول عليها باستخدام الطرد المركزي التفاضلي، يسمح البروتوكول الحصول على عدد سكانها CD14+ وحيدات مع نقاء المقررة أكثر من 98 في المائة من التدفق الخلوي (الشكل 1). هذه وحيدات تختلف بشكل ثانوي نحو اس…

Discussion

لأن البروتيوميات أداة قوية لدراسة التعبير عن البروتينات المختلفة من خلية كاملة أو مقصورات سوبسيلولار، الأمثل للبروتوكول تحلل الخلية وهضم البروتينات قد عولجت بعدد من الدراسات. وهناك ثلاث فئات رئيسية من الأساليب، التي تشمل في جل الهضم (هضم البروتينات في مصفوفة جل polyacrylamide)17، ا…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

صباحا هو الممول من قبل “برنامج زعيم مجموعة الشباب” (ATIP/افينير Inserm-يزار)، بلوس أنجليس الرابطة الوطنية le مكافحة السرطان ولوس أنجليس “مؤسسة قوس” من أجل la بحوث sur le السرطان. ونحن نشكر مارييت ماتوندو من “قياس الطيف الكتلي” لمنهاج علم الأحياء (أوتيتشس مسبيو، ومعهد باستور، باريس). ونحن نشكر لورين أندرسون للقراءة لها من المخطوطة.

Materials

Hypoxia Working Station Oxford Optronix Hypoxylab
C6 Flow cytometer BD Accuri C6
Urea Agilent Technologies 5188-6435
Formic acid (FA) ARISTAR 450122M
R-250 Coomassie blue Biorad 1,610,436
Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS) Calbiochem 437627
2D clean-up kit GE Healthcare 80-6484-51
RPMI 1640 medium, glutamax supplement Gibco 61870044
HEPES 1 M Gibco 15630-080
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X Gibco 11140-035
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X Gibco 14190-094
Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column Harvard Apparatus 74-4601
EDTA 0.5 M, pH 8.0 Invitrogen AM9260G
NuPAGE Bis-Tris 4-12% Life Technologies SAS NP0321 BOX
CD14 Microbeads human Miltenyi Biotec 130-050-201
MACS separation column LS Miltenyi Biotec 130-042-401
Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) Miltenyi Biotec 130-096-485
Interleukin 4 (IL4) Miltenyi Biotec 130-093-917
Interleukin 13 (IL13) Miltenyi Biotec 130-112-410
Interferon gamma (INFγ) Miltenyi Biotec 130-096-482
CD14-FITC (clone TÜK4) Miltenyi Biotec 130-080-701
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753
Trifluoroacetic Acid (TFA) Pierce 28904
Trypsin/Lys-C Mix PROMEGA V5073
Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail Roche 11836170001
Density Gradient Solution (Histopaque 1077) Sigma Aldrich 10771-100ML
Accumax Sigma Aldrich A7089-100ML
Human Serum from human male AB plasma (SAB) Sigma Aldrich H4522-100ML
Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30% Sigma Aldrich A9576-50ML
Trisma-base Sigma Aldrich T1503
Glycerol Sigma Aldrich 49767
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148
Bromophenol blue Sigma Aldrich 114405
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20% Sigma Aldrich 5030
Ammonium bicarbonate Sigma Aldrich 9830
Acetonitrile Sigma Aldrich 34888
Dithiothreitol Sigma Aldrich 43819
Iodoacetamide Sigma Aldrich 57670
Thiourea Sigma Aldrich T8656
CHAPS Sigma Aldrich C9426
Micro BCA Assay Kit ThermoFisher 23235
5 mL sterile plastic pipette VWR 612-1685
Thermomixer C Eppendorf VWR 460-0223
Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg Waters WAT036820

Referências

  1. Okabe, Y., Medzhitov, R. Tissue biology perspective on macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).
  2. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
  3. Murray, P. J. Macrophage Polarization. Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).
  4. Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation. Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).
  5. Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
  6. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
  7. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
  8. Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
  9. Xue, J., et al. Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation. Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).
  10. Csete, M. Oxygen in the cultivation of stem cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).
  11. Johansson, A., et al. Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).
  12. Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).
  13. Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line. PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).
  14. Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).
  15. Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
  16. Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
  17. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  18. Court, M., et al. Toward a standardized urine proteome analysis methodology. Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).
  19. Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  20. Liebler, D. C., Ham, A. -. J. L. Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics. Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).
  21. Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis. Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).
  22. Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
  23. Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells. Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
  24. Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
  25. Lengner, C. J., et al. Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations. Cell. 141 (5), 872-883 (2010).
  26. Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology. Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).

Play Video

Citar este artigo
Court, M., Malier, M., Millet, A. Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment. J. Vis. Exp. (143), e58727, doi:10.3791/58727 (2019).

View Video