如何定量光活化荧光蛋白在大容量和活细胞中的分数
Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 涉及基因耦合光谱不同的光可激活和荧光蛋白。这些荧光蛋白嵌合体允许定量的 pa-fp 分数是光活化的荧光,即光活化效率。该协议揭示了不同的光活化模式产生不同的光活化效率。
Abstract
荧光和可转换荧光蛋白 (pa-fp) 已被用于荧光活细胞显微镜分析细胞和蛋白质组合的动力学。到目前为止, 还没有方法可以在体积和活细胞中量化有多少 pa-fp 表示的光活化荧光。
在这里, 我们提出了一个涉及内部标尺的协议,即基因耦合光谱分辨 (可光能) 荧光蛋白, 以物理方式量化在被打开的细胞中表达的所有 pa-fp 的分数。荧光。利用该协议, 我们证明了不同的光活化模式产生了不同的光活化效率。利用共聚焦激光扫描显微镜 (clsm) 进行短的大功率光激活, 其光活化效率比 clsm 应用的数百次低电平曝光或宽场照明应用的短脉冲低四倍。虽然该协议已在这里为 (pa-) gfp 和 (pa-) cherry 提供了实例, 但它原则上可以应用于任何光谱上不同的可激活或光可转换荧光蛋白对和任何实验设置。
Introduction
2002年, 介绍了第一种广泛适用的光致可激活 (pa-gfp1) 和光可转换 (kaede2) 荧光蛋白。这些光学荧光笔荧光蛋白在用 uv 光照射时改变光谱特性,即它们变得明亮 (可发光荧光蛋白,即pa-fp), 或改变其颜色 (可转换光(fp)。到目前为止, 已经开发出了一些可逆和不可逆的光活性和可光可维化荧光蛋白。在集成或体积研究中, 光学荧光笔被用来研究整个细胞或蛋白质的动态, 以及亚细胞隔间的连接性。此外, 光学荧光笔支持基于单分子的超分辨率成像技术, 如 palm5和 fpalm6.
虽然在光活化或转换过程中的光化学过程已经描述了许多光学荧光笔,甚至在光电激活/转换之前和之后的晶体结构已经提供了7,8、光激活和转换的底层照片物理机制尚不完全清楚。此外, 到目前为止, 只有粗略的估计存在光活化和转换的效率, 即实际表示的光转换或光活化为荧光的荧光蛋白的分数。体外整合研究已报告定量的变化, 在一个凝胶9,10,11的吸收光谱和原生和活化蛋白的数量。
在这里, 我们提出了一个协议, 涉及荧光蛋白嵌合体, 以评估光激活荧光蛋白在体积和活细胞中的分数。每当使用基因编码的荧光蛋白时, 所表达的蛋白质的绝对数量因细胞而异, 是未知的。如果一个表示 pa-fp 的单元在光激活后显示出比另一个单元更明亮的信号, 则如果这种更明亮的信号是由于 pa-fp 的更高表达或 pa-fp 的更有效的光激活而导致的, 则无法区分该信号。为了规范细胞中的表达水平, 我们引入了基因耦合光谱不同荧光蛋白的内部规则。通过将光可激活荧光蛋白的遗传信息与光谱上的始终在线荧光蛋白耦合, 生成了仍可表示为未知总量的内部标尺, 但其相对数量固定在一个固定的和已知的相对数量中。1. 这一战略允许对不同的紫外光光活化方案进行定量表征,即评估可以用不同光活化模式进行光活化的 pa-fp 的相对数量, 从而允许定义比其他方案更有效的光激活方案。此外, 这一战略原则上允许对光激活的 pa-fp 分数的绝对量化进行评估。为此, 重要的是要认识到, 所提出的集成研究是基于强度的, 这使得本协议所规定的分析更加复杂。在比较不同荧光蛋白的荧光强度时, 需要考虑确定测量荧光强度的参数,即不同的分子亮度、吸收率和发射光谱以及 fret 效应。
以比例强度为基础的光活化效率定量为例, 说明了在活细胞中的 pa-gfp 和 pa-cherry, 但原则上广泛适用, 可用于任何光活化荧光蛋白。实验条件。
Protocol
Representative Results
Discussion
到目前为止, 还没有方法来批量测定在光活化为荧光的活细胞中表达的 pa-fp 的分数。该协议可用于任何光谱不同的荧光蛋白对。虽然这里的例子是不可逆转的 pa-fp pa-gfp 和 pa-cherry, 但这种方法原则上也适用于光可转换蛋白。然而, 必须仔细选择光谱不同的荧光蛋白, 以最大限度地减少光谱重叠, 因为光可转换荧光蛋白会将其吸收光谱和发射光谱从绿色转移到红色荧光。
如…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢斯坦福大学医学院的多罗实验室和神经科学成像服务机构为这一项目提供了设备和空间。
Materials
| pEGFP-N1 mammalian cell expression vector | Clontech | ||
| DMEM w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Trypsin w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
Referências
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