Photoactivated 형광 단백질 대량 및 라이브 셀의 일부분을 계량 하는 방법
Summary
여기, 선물이 형광 단백질 유전자 결합된 괴기 하 게 명료한 photoactivatable를 포함 하는 프로토콜. 이러한 형광 단백질 키메라 photoactivation 효율성 즉, 형광, 수의 photoactivated는 PA FP 분수의 정량화를 허용 합니다. 프로토콜은 photoactivation의 다양 한 모드로 다른 photoactivation 효율성 산출을 보여준다.
Abstract
Photoactivatable 및-컨버터블 형광 성 단백질 (PA-FPs) 세포와 단백질 앙상블의 역학을 분석 하기 위한 형광 라이브 셀 현미경에 사용 되었습니다. 지금까지, 방법은 없습니다 대량에서 계량 수 되었으며 라이브에서 PA-FPs의 얼마나 많은 표현 세포 형광을 photoactivated 있습니다.
여기, 우리가 현재 내부 통치자를 포함 하는 프로토콜, 즉, 유전자 결합 spectrally 별개 (photoactivatable) 형광 단백질, ratiometrically 모든 PA-FPs의 것에 전환 하는 셀에 표시의 일부분을 계량 형광. 이 프로토콜을 사용 하 여, 우리는 photoactivation의 다양 한 모드로 다른 photoactivation 효율성 나왔고 보여줍니다. Confocal 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM) 짧은 고 전력 photoactivation CLSM으로 적용 하는 낮은 수준의 노출 또는 widefield 조명에 의해 적용 짧은 펄스의 수백 보다 4 배 더 낮은 photoactivation 효율까지 결과. 프로토콜 GFP (펜 실바 니 아-)와 (펜 실바 니 아-) 체리 여기 궁 행 되는, 하는 동안 그것은 원칙에 적용할 수 있습니다 어떤 괴기 하 게 명료한 photoactivatable 또는 photoconvertible 형광 단백질 쌍 및 모든 실험 설정.
Introduction
2002 년, 첫 번째 광범위 하 게 적용 가능한 photoactivatable (PA-GFP1) 및 photoconvertible (가2) 형광 단백질 설명 했다. 자외선과, 즉, 방사선 조사 시 스펙트럼 그들의 속성을 변경 하는이 광 형광펜 형광 단백질 그들은 밝은 될 (photoactivatable 형광 성 단백질, 즉, PA FPs), 또는 (photoconvertible 그들의 색상을 변경 FPs)입니다. 날짜 하려면, 여러 가지 되돌릴 수와 돌이킬 수 없는 photoactivatable 및 photoconvertible 형광 단백질 개발된3,4되었습니다. 앙상블 또는 대량 연구, 광학 형광펜 subcellular 구획의 연결 전체 셀 또는 단백질의 역학을 공부 하 고 사용 되었습니다. 또한, 광학 형광펜 사용 단일 분자 이미징 기술이 팜5 FPALM6해상도 기반으로 합니다.
비록 중 사진화학 처리 photoactivation 또는-변환 설명 되었습니다. 많은 광학 형광펜 및 심지어 결정학 구조 photoactivation 전후 /-변환 사용할 수7 되었습니다. , 8, photoactivation 및-변환의 기본 사진물리적 메커니즘 완전히 이해 하지는. 또한, 지금까지 원유 추정 존재의 photoactivation-변환 효율의 즉, 즉 표현 형광 단백질의 분수 실제로 photoconverted 또는 형광 수 photoactivated. 네이티브의 양과 흡수 스펙트럼의 변화를 측정 하 고 젤9,,1011에 단백질 활성화 앙상블 연구 생체 외에서 보고 되었습니다.
여기, 선물이 photoactivated 형광 단백질 대량에서 및 라이브 셀에 분수를 평가 하기 위해 형광 단백질 키메라를 포함 하는 프로토콜. 때마다 형광 단백질 유전자 인코딩된 작업, 표현 하는 단백질의 절대 크기가 셀에서 변화 하 고 알. PA FP를 표현 하는 하나의 셀 다른 셀 보다 photoactivation 후 밝은 신호를 보여줍니다, 경우이 밝은 신호 파 FP의 높은 식 또는 PA-FP의 더 효율적인 photoactivation 분화 될 수 없습니다. 셀에 식 수준 표준화, 유전자 결합된 spectrally 고유한 형광 단백질의 내부 통치자 소개 합니다. 괴기 하 게 뚜렷한 항상에 형광 단백질, 내부 통치자 photoactivatable 형광 단백질의 유전 정보가 만들어집니다 커플링으로는 여전히 표현 됩니다 알 수 없는 총 금액만의 고정 및 알려진 상대 금액에서 1:1.이이 전략 수 제도의 다른 UV 빛 photoactivation, 즉, 양적 특성 photoactivation, 다른 모드와 photoactivated 수를 그로 인하여 허용 PA FPs의 상대적인 양의 평가 다른 사람 보다 더 효과적인 photoactivation 스키마를 정의 합니다. 또한,이 전략 photoactivated PA FP 분수의 절대 정량화 평가 원리에 있습니다. 이 위해, 그것은 제시 앙상블 연구는 강도-기반 분석으로이 프로토콜에 누워 복잡 한 게 실현 하는 것이 중요. 측정 된 형광 강도, 즉, 다른 분자 밝기, 흡 광도 및 방출 스펙트럼 무서 워 효과 결정 하는 매개 변수 다른 형광 단백질의 형광 강도 비교할 때 고려 될 필요가 있다.
Photoactivation 효율성의 제시 비율 강도 기반 정량화 GFP PA 및 PA-벚꽃 라이브 셀에 대 한 예증 하지만 원칙적으로 광범위 하 게 적용 및 어떤 photoactivatable 형광 단백질에서 사용 될 수 있습니다. 실험 조건입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
지금까지, 방법은 없습니다 대량에서 PA-FPs의 라이브 셀에서 표현 photoactivated 형광 하는 분수 결정에 존재. 어떤 괴기 하 게 고유한 형광 단백질 쌍 제시 프로토콜을 사용할 수 있습니다. PA FPs PA-GFP와 PA-체리는 돌이킬 수 없는 대 한 여기 exemplified, 동안이 방식은 원칙적으로 뿐만 아니라 photoconvertible 단백질에 적용 합니다. 그러나 괴기 하 게 고유한 형광 단백질,, 선택 되어야 합니다 신중 하 게 photo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는이 프로젝트에 대 한 장비와 공간을 제공 하기 위한 Dorigo 실험실 그리고 스탠포드 대학의과 대학에서 신경 과학 이미징 서비스를 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| pEGFP-N1 mammalian cell expression vector | Clontech | ||
| DMEM w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Trypsin w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
Referências
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