Hoe te kwantificeren van de Fractie van Photoactivated fluorescerende eiwitten in Bulk en in levende cellen
Summary
Hier presenteren we een protocol waarbij genetisch gekoppelde spectraal verschillende photoactivatable en fluorescente proteïnen. Deze TL proteïne Chimaera toestaan kwantificering van de PA-FP-breuk thats photoactivated als tl, dat wil zeggen, de efficiëntie van de photoactivation. Het protocol blijkt dat verschillende vervoerswijzen photoactivation verschillende photoactivation efficiëntieverbeteringen opleveren.
Abstract
Photoactivatable en -converteerbare fluorescente proteïnen (PA-FPs) hebben in fluorescentie live-cel microscopie is gebruikt voor het analyseren van de dynamiek van cellen en eiwit ensembles. Tot nu toe geen methode beschikbaar te kwantificeren in bulk geweest en in levende cellen hoeveel van de PA-FPs uitgedrukt zijn photoactivated te lichten.
Hier presenteren we een protocol met betrekking tot interne heersers, dat wil zeggen, genetisch waaraan spectraal onderscheiden (photoactivatable) fluorescente proteïnen, ratiometrically kwantificeren van de Fractie van alle PA-FPs, uitgedrukt in een cel die zijn ingeschakeld als TL. Met behulp van dit protocol, laten we zien dat de verschillende vervoerswijzen photoactivation verschillende photoactivation efficiëntie opgeleverd. Korte high-power photoactivation met een confocale laser scanning microscoop (CLSM) resulteerde in tot viermaal lagere photoactivation efficiëntie dan honderden low-level vorderingen toegepast door CLSM of een korte puls toegepast door widefield verlichting. Terwijl het protocol heeft hier zijn geïllustreerd voor (PA-) GFP en Cherry (PA-), kan het in principe worden toegepast op elk spectraal verschillende photoactivatable of photoconvertible TL proteïne paar en een experimentele opstelling.
Introduction
In 2002, werden de eerste breed toepasbare photoactivatable (PA-GFP1) en photoconvertible (Kaede2) fluorescente proteïnen beschreven. Deze optische markeerstift fluorescente proteïnen wijzigen hun spectrale eigenschappen bij bestraling met UV-licht, dat wil zeggen, ze helder (photoactivatable fluorescerende eiwitten, dat wil zeggen, PA-FPs) of hun kleur (photoconvertible wijzigen FPs). Tot op heden, zijn verschillende omkeerbaar en onomkeerbare photoactivatable en photoconvertible fluorescerende eiwitten ontwikkelde3,4. In ensemble of bulk studies, zijn optische markeerstiften gebruikt om de dynamiek van hele cellen of eiwitten, en de connectiviteit van subcellular compartimenten te studeren. Bovendien gebaseerd optische markeerstiften ingeschakeld single-molecuul super-resolution beeldvormende technieken zoals PALM5 en FPALM6.
Hoewel de foto-chemische tijdens processen photoactivation of -conversie zijn beschreven voor vele optische markeerstiften en zelfs kristallografische structuren voor en na photoactivation / – conversie beschikbaar7 zijn aangebracht , 8, het onderliggendefysieke mechanisme van de foto van photoactivation en -conversie is niet volledig begrepen. Bovendien, tot nu toe slechts ruwe schattingen bestaan uit de efficiëntie van photoactivation en -conversie, dat wil zeggen, de Fractie van fluorescente proteïnen uitgedrukt dat is eigenlijk photoconverted of photoactivated als tl. In vitro ensemble studies hebben gemeld kwantificering van de verschuiving in de absorptiespectra en het bedrag voor native en geactiveerd proteïne in een gel9,10,11.
Hier presenteren we een protocol waarbij fluorescent proteïne Chimaera om te beoordelen van de Fractie van photoactivated fluorescerende eiwitten in bulk en in levende cellen. Wanneer werkt met genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten, de absolute hoeveelheid eiwit uitgedrukt varieert van cel naar cel en is onbekend. Als één cel uiting van een PA-FP een helderder signaal na photoactivation dan een andere cel toont, kunnen niet worden onderscheiden als dit helderder signaal te wijten aan hogere uitdrukking van het PA-KP of een efficiënter photoactivation van het PA-KP is. Om te standaardiseren op het niveau van de expressie in cellen, introduceren we interne heersers van genetisch gekoppelde spectraal verschillende fluorescente proteïnen. Door koppeling van de genetische gegevens van een photoactivatable TL proteïne aan een spectraal verschillende altijd-op fluorescente proteïnen, interne linialen worden gemaakt die zal nog steeds worden uitgedrukt aan een onbekende totaalbedrag maar in een vaste en bekende relatieve hoeveelheid 1: 1. deze strategie staat de kwantitatieve karakterisering van verschillende UV-licht photoactivation regelingen, dat wil zeggen, de beoordeling van de relatieve hoeveelheid PA-FPs die kan worden photoactivated door de verschillende modi van photoactivation, en daardoor vergunningen definiëren van photoactivation regelingen die effectiever dan anderen zijn. Bovendien kan deze strategie in beginsel de beoordelingvan de absolute kwantificering van de photoactivated PA-FP breuk. Te dien einde is het belangrijk om te beseffen dat de gepresenteerde ensemble studies intensiteit gebaseerde waardoor de analyse meer complexe zijn zoals uiteengezet in dit protocol. Parameters bepalen de gemeten fluorescerende intensiteit, d.w.z., verschillende moleculaire helderheid, absorptie en emissie spectra en FRET effecten moeten worden overwogen bij het vergelijken van de fluorescentie intensiteiten van verschillende fluorescente proteïnen.
De kwantificering van de intensiteit gebaseerde van de gepresenteerde ratiometric van photoactivation-efficiëntie wordt geïllustreerd voor PA-GFP en PA-kers in levende cellen, maar is in principe breed toepasbare en kan worden gebruikt voor een photoactivatable fluorescerende eiwit onder experimentele conditie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tot nu toe bestond geen methode om te bepalen in de bulk van de Fractie van de PA-FPs uitgedrukt in levende cellen die photoactivated als tl. Het gepresenteerde protocol kan worden gebruikt voor elk paar spectraal verschillende fluorescente proteïne. Terwijl geïllustreerd hier voor de onomkeerbare PA-FPs PA-GFP en PA-Cherry, is deze aanpak in principe van toepassing op photoconvertible eiwitten zo goed. De spectraal verschillende fluorescente proteïne, echter moet worden geselecteerd zorgvuldig om te minimaliseren van…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij wil het Dorigo laboratorium en de neurowetenschappen Imaging Service aan Stanford University School of Medicine bedanken voor het verstrekken van apparatuur en ruimte voor dit project.
Materials
| pEGFP-N1 mammalian cell expression vector | Clontech | ||
| DMEM w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Trypsin w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
Referências
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Day, R. N., Davidson, M. W. Ch. 9. The Fluorescent Protein Revolution Series in Cellular and Clinical Imaging. , 201-228 (2014).
- Shcherbakova, D. M., Sengupta, P., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Photocontrollable fluorescent proteins for superresolution imaging. Annual Review of Biophysics. , 303-329 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Henderson, J. N., et al. Structure and mechanism of the photoactivatable green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (12), 4176-4177 (2009).
- Subach, F. V., et al. Photoactivation mechanism of PAmCherry based on crystal structures of the protein in the dark and fluorescent states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21097-21102 (2009).
- Wiedenmann, J., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3 (12), e3944 (2008).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6 (2), 153-159 (2009).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Slocum, J. D., Webb, L. J. A Double Decarboxylation in Superfolder Green Fluorescent Protein Leads to High Contrast Photoactivation. Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (13), 2862-2868 (2017).
- Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6481-6491 (2010).
- Renz, M., Wunder, C. Internal rulers to assess fluorescent protein photoactivation efficiency. Cytometry A. , (2017).
- Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), E2989-E2997 (2012).
