여기, 우리가 현재 생산과 retroviral 변환 및 또는 lymphodepleting 없이 BALB/c 마우스에서 설립된 syngeneic A20 B-세포 림프 종에 대 한 치료로 활용 하 여 murine CD19 차 T 세포의 전 임상 시험에 대 한 프로토콜 미리 컨디셔닝.
CD19 공상 항 원 수용 체 (자동차) T-세포 치료의 놀라운 임상 성공 급성 림프 구성 백혈병 (ALL) andnon-Hodgkin 림프 종 (NHL)에 대 한 두 번째 세대 공상 항 원 수용 체 (자동차)의 승인을 주도하 고 있다. 필드의 초점은 이제 덜 인상적 완전 한 응답 속도 관찰 된다 다른 혈액 악성 종양에서 이러한 성공을 모방에 있습니다. 자동차 T 세포 또는 다른 치료 modalities의 공동 관리의 엔지니어링 추가 다른 암 설정에서 성공적인 치료에 장애물 극복 성공적으로 수 있습니다.
우리는 따라서 다른 CD19 자동차 T 세포의 전 임상 테스트 수행할 수 있는 모델을 제시. 이 테스트 B-세포 림프 종 모델 결과 일반적으로 유익한 자동차 T-세포 치료 될 것.
이 프로토콜을 사용 마우스의 재현 생산 MP71 retroviral 구조와 pCL 에코 포장 플라스 미드 retroviral 입자 분 비의 컬렉션 뒤 같은 E 프로듀서 셀 칼슘 인산 염 transfection 통해 자동차 T 세포와 재조합 인간 fibronectin 조각 및 원심 분리를 사용 하 여 변환입니다. Retroviral 변환의 유효성 검사 및 확인 대상 림프 종 세포 vivo ex, cytometry, luminometry 및 효소 연결 된 immunosorbent 사용 죽 차 T 세포 수의 시험 (ELISA), 또한 설명.
프로토콜 테스트 차 T 세포 vivo에서 lymphoreplete에 고 lymphodepleted syngeneic 마우스, 베어링 설립, 조직 림프 종 같습니다. 안티-암 활동 vivo에서 생물 발광 및 질병 진행에 의해 모니터링 됩니다. 우리 때 1세인트 또는 lymphodepleting 사전 및 자동차 T를 활용 하 여 장기 remissions 달성 하는 쥐의 소수와 함께 2차 세대 자동차 설립된 B-세포 림프 종의 근절의 전형적인 결과 보여 셀 lymphoreplete 쥐에 IL-12를 표현입니다.
이러한 프로토콜은 다른 추가 수정, 차 T 세포의 조합 및 다른 치료제와 CD19 차 T 세포를 평가 하는 데 사용 하거나 다른 대상 항 원에 대 한 자동차 T 세포의 사용을 위해 적응 수 있습니다.
공상 항 원 수용 체 (자동차) T-세포 치료의 CD19 치료에 놀라운 임상 성공을 보이고 있다+ 재발된 급성 림프 구성 백혈병1 과 axicabtagene tisagenlecleucel의 승인에 지도 하는 악성 종양 진보적인 큰 B-세포 비 Hodgkin 림프 종2 2017에 대 한 ciloleucel.
암과 질병의 진행 및 치료 메커니즘 모두에서 면역 체계 사이 상호 작용의 중요성은 점점 더 인식된3,4,되 고5. 예, 그것은 잘 종양 microenvironment (TME) 면역 세포6,,78의 이펙터 기능을 억제할 수 있는 요인으로 맞이 하 게 됩니다 문서화. 또는 생 면역 세포와 epitope 확산 못쓰게 종양 퇴치 및 장기 저항 종양 도전9,10키 수 있습니다. 이러한 현상의 둘 다 면역 체계가 부족 xenogeneic 모델에서 평가할 수 없습니다. 마찬가지로, 유전자 변형 단백질을 이용 하 여 시스템 epitope11,12확산에 필요한 면역 관용을 깨는 도전을 정확 하 게 반영 하지 않습니다. 따라서, 완전 한 기능 면역 체계와 syngeneic 모델은 암 질병 진행 및 면역 치료제의 이러한 중요 한 측면을 모델링을 위한 파라마운트.
자동차 T-세포 치료의 중요 한 경고 lymphodepleting 사전 조절 치료 성공13,14필요 하다는 것 이다. 이것은 일반적으로 자동차 T 세포15,16의 주입 전에 화학요법을 투여 하 여 환자에 달성 된다. 표준 방법으로 환자의 설정에서 사용 하는 lymphodepletion를 모방 하기 위해 우리 관리 5 Gy 총 몸 방사선 조사 (TBI) 마우스 베어링 조직의 A20 B-세포 림프 종 치료 차 T 세포의 이전 lymphodepletion를 달성 하기 위해.
Lymphodepleting 사전 컨디셔닝 대부분의 환자에 대 한 문제가 되지 않습니다, 하는 동안 화학요법 에이전트와 함께 제공 되는 독성의 낮은 성능 상태 환자 차 T-세포 치료 받을 수 있습니다 의미 합니다. Lymphodepletion에 대 한 부적격 환자를 나타내는 테스트 시스템을 만들려면, 우리는 우리가 자동차 T-세포 림프 종 치료 모델 lymphoreplete syngeneic 마우스 모델 설립. 이 모델에서 차 T 세포 내에서 IL-12의 분 비의 성공률와 함께 설립된 림프의 박멸 이어질 수 살펴보았습니다 ~ 2517. 또한, 우리는 내 생 면역 세포 암 퇴치에 참여 했다 보였다.
여기 우리가 자세히 설명 마우스 자동차 T 세포의 생산을 위한 프로토콜 syngeneic 쥐 및 또는 lymphodepleting 사전 컨디셔닝의 사용 없이 차 T 세포 림프 종 치료에 림프 종 설립. 이 다른 transgenes 차 T 세포를 테스트 하는 다른 에이전트와 자동차 T 세포의 조합 연구 또는 림프 종에 대 한 다른 입양 세포 치료 또는 immunotherapy 전략의 사용에 대 한 사용할 수 있습니다.
Syngeneic 마우스 모델 그대로 면역 시스템을 유지 하면서 질병 진행 및 치료의 테스트 수 있습니다. 이것은 파라마운트 immunotherapeutic 에이전트에 대 한 특히에서 면역 체계와 상호 작용 하는 치료에 관해서입니다.
여기에 설명 된 프로토콜은 두 가지 중요 한 작업 흐름, 첫 번째 자동차를 표현 하기 위해 마우스 T 셀을 수정 하 고 유전자. 이 변환의 유효성 검사 개시 7 일 필요합니다. 자동차 T 세포의 생산을 수 반하는 생쥐에서 조직의 림프의 설립이 이다. 자동차 T 세포 생산 실패 하거나 품질 되 고 부족, 거기 아니다 일반적으로 충분 한 시간 전에 마우스 대체 전지를 생산 하는 림프 종에 굴복 해야 합니다. 따라서 연구팀은 정확 하 게이 모델을 사용 하 여 성공적으로 치료 관리에 대 한 자동차 T 세포의 생산을 시간 순서 종양 투약 하 고 질병 진행 연구를 수행 하는 중요 한 이다.
낮은 T-셀 변환 효율에 대 한 일반적인 이유는 프로듀서 셀, 일반적으로 불 쌍 한 플라스 미드 순도 또는 transfection 미디어의 pH의 부정확 한 결정으로 인 한 가난한 transfection 효율 포함 되어 있습니다. 가난한 transfection T-셀 변환 효율 제한으로 전체 프로토콜 함께 진행 하기 전에 프로듀서 셀 transfection 효율을 확인 하는 것이 좋습니다. 그러나 재조합 인간 fibronectin 조각 수집 될 수 있으며 다시 사용 하는,-20 ° C에, 감소 된 변환 효율성에 여러 동결 해빙 결과 저장. 마우스 spleens 후 컬렉션은 또한 높은 얻는 것이 중요의 신속한 처리 가능한 T 세포의 생성 합니다.
여기에 설명 된 프로토콜 A20 셀 luciferase 표현 활용을 주목 한다. 이것은 선호 생물 발광 영상으로 조직의 종양 부담을 측정 하는 능력을 제공 합니다. 그러나, 기능적인 면역 체계의 존재 luciferase 응답 결과 왜곡 수 있습니다. 이전 마커 transgenes17에 쥐를 살아 나 기의 면역 반응을 테스트 했습니다. 그것은 이러한 면역 세포에 의해 종양 퇴치에 중요 한 역할을 재생 하지 않는 유효성을 A20 셀 transgenes의 무료를 사용 하 여 주요 실험을 복제 열쇠입니다.
임상 에이전트 사용 vivo에서 면역 결핍 생쥐에서 하실 수 있습니다, 하는 동안 마우스 암 세포에 대 한 마우스 자동차 T 세포를 사용 하 여 우리가 치료 효능 또는 질병 진행에 면역 체계의 기여를 평가 수 있습니다. 이 프로토콜 B-세포 림프 종 또는 IL-12 여기에 설명 된 대로의 분 비 등 추가 수정와 다른 자동차를 대상으로 하는 자동차의 전 임상 평가 위해 활용 될 수 있습니다. 그것은 그 면역 세포 사이 상호 작용 syngeneic 마우스 모델에서 평가 될 수 있습니다, 하지만 그들은 수 있습니다 하지 정확 하 게 정리 vivo에서인간 상호 작용을 언급 해야 합니다. 특히의, 인간 및 마우스 자동차 구조는 다운스트림 결과;에 달라 집니다. T 세포의 성장 위한 최적 활성화 및 셀 문화 조건에 다른20, 대상 항 식의 조직 분포 인간과 쥐 사이 다를 수 있습니다 및 경험 있는 독성 근본적으로 다를 수 있습니다. 그러므로 전 비보 및 결과 승산이 xenogeneic 모델 활용 필수적 이다.
요약 하자면, syngeneic lymphodepleted 및 lymphoreplete 모델의 림프 종 환자와 이전 항 암 치료/방사선 치료 없이 정리. 이 다양 한 새로운 면역 치료 대리인의 오는 파도와 중요 한 치료 전략의 테스트 수 있도록 임상 설정을 모방 하는 모델 시스템을 제공 합니다.
사전 컨디셔닝의 사용, 그것은 모든 마우스는 일반적으로 림프 종 선택을 취소 표시 됩니다. 와 최대 90% 완료 응답 속도 인간에서는, 이것은 대표입니다. 그러나 CD19 차 T-세포 치료에 대 한 도전을 relapses 관찰의 높은 주파수를 방지에 경첩 것입니다, 그는 종종 CD19. Relapses 하지 관찰 되었습니다이 모델에서, 그리고 종종 100 일 넘어. 병원에서 본 relapses 모방 수정 CD19 차 T-세포 치료의 미래 과제 도울 수 있었다.
The authors have nothing to disclose.
우리는이 연구 (그랜트 13031)와 CRUK 맨체스터 생물 자원 단위, 이미징 및 cytometry 및 분자 생물학 핵심 시설이이 작업을 지원 하기 위한 자금에 대 한 Bloodwise를 감사 하 고 싶습니다.
0.2 µm syringe filter | Appleton Woods | FC121 | |
0.45 µm syringe filter | Appleton Woods | FC122 | |
1.5ml pestle and microtube | VWR | 431-0098 | |
100X penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Gibco | 10378016 | |
2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350–010 | |
Blasticidine S hydrochloride | Sigma- Aldrich | 15205 | |
Bottle Top Filter (0.2 µm) | Scientific Laboratory Supplies | FIL8192 | |
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100759 | 1 in 100 staining dilution. Clone 53-6.7 |
Brilliant Violet 785 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100552 | 1 in 100 staining dilution. Clone RM4-5 |
Calcium chloride dihydrate | Sigma- Aldrich | C7902 | |
Cell counting beads – CountBright absolute counting beads | Molecular Probes | C36950 | |
Cell Strainer 100μm | VWR | 734-0004 | |
Cyclophosphamide Monohydrate | Merck | 239785-1GM | |
Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) – High Glucose | Sigma Aldrich | D6546 | |
Dynabeads | Gibco | 11131D | |
Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | GE17-1440-03 | Sold by Sigma- Aldrich |
Flow cytometer – LSR Fortessa x20 | BD Biosciences | 658222R1 | |
Foetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
Haemacytometer | Appleton Woods | HC001 | |
HEPES solution | Sigma- Aldrich | H0887 | |
IL-12 p70 Mouse Uncoated ELISA Kit | Invitrogen | 88-7121-76 | |
IL2, Proleukin | Novartis | PL 00101/0936 | |
in vivo bioluminescence imaging system – in vivo xtreme II imaging system | Bruker | T149094 | |
Ionomycin Calcium Salt | Sigma- Aldrich | I0634 | |
Live/dead stain – Zombie Violet Fixable Viability Kit | BioLegend | 423114 | 1 in 100 staining dilution |
Luminometer – Lumistart Omega | BMG Labtech | 415-301 | |
Murine IFN-γ ELISA kit | Diaclone | 861.050.010 | |
Paraformaldehyde | Sigma- Aldrich | 16005 | |
pCL-Eco | Novus Biologicals | NBP229540 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma- Aldrich | P8139 | |
Platinum E cell line | Cell Biolabs | RV-101 | (RRID:CVCL_B488) |
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | Clone 37.51 |
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3ε | BD Biosciences | 553057 | Clone 145-2C11 |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | 1 in 100 staining dilution. Clone 2.4G2 |
Puromycin Dihydrochloride | Sigma- Aldrich | P8833 | |
Recombinant human fibronectin fragment – RetroNectin Reagent | TaKaRa | T100B | |
Recombinant Mouse IL-7 (carrier-free) | BioLegend | 577806 | |
Red cell lysis buffer | eBioscience | 004-4333-57 | |
RPMI 1640 Medium | Lonza | BE12-167F | |
Trypsin – EDTA solution | Sigma- Aldrich | T3924 | |
XenoLight D-Luciferin | Perkin Elmer | 122799 |