Um modelo de linfoma de célula B Syngeneic Mouse para avaliação pré-clínica de pilhas de T de carro CD19

Todas as experiências em animais foram realizadas sob os auspícios da lei de animais (procedimentos científicos) 1986 e sob UK Coordinating Committee para orientações de pesquisa do câncer. Todos os estudos em animais foram conduzidos no Instituto CRUK-Manchester e aprovados pelo bem-estar dos animal local e ética rever corpo (CRUK-MI AWERB). 1. preparações PMP71 de Maxiprep retroviral construir plasmídeo e pCL-Eco retrovírus embalagem plasmídeos18.Nota: pMP71 codifica mCherry e separadas por uma sequência de FMDV2A o carro. Isto é intercambiável com outras construções retrovirais. pCL-Eco codifica gag, pol e as proteínas do envelope ecotropic. Prepare o suporte de célula T completa (TCM) para cultivo de células de rato T usando meio RPMI 1640, FCS de 10%, 1% 100 x penicilina-estreptomicina-glutamina (PSG).Nota: A solução contém penicilina 100 UI/mL, 100 mg/mL de estreptomicina e 2mm da L-glutamina), 50 μM β-Mercaptoetanol e 25mm 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES). Cultura de células A20 em RPMI 1640, 10% FCS e β-Mercaptoetanol de 0,05 mM a 37 ° C, 5% de CO2. Cultura das células de platina-E (Plat-E) no meio de eagle modificado de Dulbecco completa (DMEM) (DMEM com soro fetal bezerro de 10% (FCS), 2 mM L-glutamina, 1 puromicina μg/mL e 10 μg/mL blasticidin) a 37 ° C, 5% CO2.Nota: Plat-E as células são derivadas de células 293T e expressam proteínas retrovirais de gag, pol e ecotropic envelope. Prepare a transfeccao soluções de mídia 1 e 2 imediatamente antes do transfection. Prepare a solução 1 (pH 7.9) para conter DMEM + 10% FCS + 25mm HEPES, solução 2 (pH 7,1) para conter DMEM + 25mm HEPES. Prepare-se 10 μg/mL de solução de fragmento de fibronectina humana recombinante diluindo com solução salina tampão fosfato (PBS) e armazenar a-20 ° C até o uso. Todos os meios de filtro de estéril através de 0,2 μm filtros antes do uso (excluindo fibronectina humana recombinante fragmento). 2. retroviral transdução de células T Dia 1: Preparação para transfeccao Semente de 7,5 x 106 Platinum-E (Plat-E) células em pratos de cultura de tecidos de2 de 15 cm em 18 mL de DMEM completa e incubar durante uma noite a 37 ° C, 5% de CO2. Dia 2: Transfection da linha de celular de empacotamento retroviral Plat-E Prepare 20.4 μg de vetor de empacotamento de pcl-Eco DNA, 39,6 μg de DNA de plasmídeo codificação retroviral construção de carro e 150 μL de 1 M CaCl2 para volume final de 3 mL de solução de transfeccao 2 por prato de2 de 15 cm a transfected. Vórtice 10 s e resto por 5 min Remova a mídia DMEM pratos de2 a 15 cm e substitua com 12 mL de solução de transfeccao 1.Cuidado Ao alterar os meios de comunicação, pratos de2 a 15 cm podem secar no centro. Isso pode causar morte substancial de células transfectadas de Plat-E. Trabalhar rapidamente e retire mídia apenas 1-2 chapas de cada vez. Adicione 3 mL de solução de transfeccao 2 contendo DNA e CaCl2 para cada prato de2 15 cm drop-wise, uniformemente através de cada placa. Suavemente de placas de pedra com um movimento lateral para 10 s. Incubar a 37 ° C, 5% CO2 durante a noite. Dia 3: Preparação de vírus contendo sobrenadante para transdução Substituir os meios de comunicação de células transfectadas de prato-E com 18 mL concluir TCM e retornam para a incubadora.Cuidado Quando os mídia 15cm2 pratos mudam pode secar no centro. Isso pode causar morte substancial de células transfectadas de Plat-E. Trabalhar rapidamente e retire mídia apenas 1-2 chapas de cada vez. Dia 3: Isolamento e em vitro a ativação de células T no baço de rato Remover baços de ratos BALB/c 6-8-week-old conforme descritos por Parkinson et al 19 e mergulhe-os em estéreis e gelada, PBS em um tubo cónico de 50 mL. Use uma pinça para transferir um baço para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL e homogeneizar usando um pilão com força mínima. Usar uma pipeta de 1000 μL e ~ 800 μL PBS para transferir homogeneizado para um coador de célula de poros 100 μm Aposto em um tubo de 50 mL contendo 5 mL de PBS para atingir uma suspensão de célula única. Repita a etapa 2.4.2 para os baços adicionais. Não exceda 3 baços por tubo.Cuidado Splenocytes passada filtro podem formar aglomerados se fica de pé. Manualmente do redemoinho tubos intermitentemente se processando vários baços para evitar a aglutinação de células. Restantes fragmentos sobre o filtro de célula podem ser ainda mais purê usando um êmbolo de uma seringa de 5 mL, utilizando a força mínima. Superior a 20 mL com PBS. Camada a suspensão de células de 20 mL com cuidado na 20 mL de mídia de gradiente de densidade (Tabela de materiais) em um tubo de 50 mL. Centrifugar a suspensão resultante sobreposta a 800 x g por 20 min com nenhum freio aplicado. Colheita de células na camada de interface usando uma pipeta Pasteur esterilizada e transfira para um tubo de 50 mL. Top com PBS e centrifugar 800 x g durante 10 minutos para lavar até 50 mL. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em TCM completa. Conte o número de células usando um hemocytometer. Cultura de células em uma densidade de 5 x 106 células/mL em TCM completa com anticorpo de anti-CD3ε 30 ng/mL (Clone 145-2 C 11), 30 anticorpo anti-CD28 de ng/mL (Clone 37.51), 100 U/mL recombinante humano Il-2 e recombinação de 2 ng/mL murino IL-7. Use um frasco de cultura de tecidos de tamanho adequado para o volume das células colhidas.Nota: Apresenta células antígeno–são necessárias para a ativação de células T por anticorpos CD3 e CD28, se trabalhando com células purificadas de T é necessário para placas de revestimento com anticorpos, ou usam grânulos magnéticos (Tabela de materiais) Incube o rato splenocytes a 37 ° C, 5% CO2 durante a noite. Dia 3: Elaboração de placas de transdução Casaco-tecido-cultura 6-poços chapas com 2 mL de 10 μg/mL de fibronectina humana recombinante fragmentam e incubam durante a noite a 4 ° C. Dia 4: Transdução de pilhas do rato T Transferi o fragmento recombinante humano fibronectina de placas revestidas fresco-tecido-cultura 6-poços chapas. Incube a estas placas durante a noite a 4 ° C, para o 2º round de transdução. Adicionar 2 mL de TCM para cada poço de placas com revestimento em fragmento recombinante fibronectina humana original e deixe por 30 min à temperatura ambiente para bloquear a ligação não-específica. Retrovírus contendo sobrenadante de células transfectadas de Plat-E em pratos de cultura de tecidos de 15 cm e substituir com 18 mL de TCM total da colheita.Cuidado Trabalha rapidamente para evitar a secagem das células Plat-E.Nota: Sucesso do transfection pode ser verificado, nesta fase, por microscopia de fluorescência se utilizando um gene marcador fluorescente como mCherry (Figura 1). Filtre o sobrenadante contendo retrovírus 0,45 μm filtro para remover os resíduos de célula. Retire TCM fibronectina humana recombinante fragmento-revestido 6-poços chapas e adicionar 2,5 mL de filtrado retrovírus contendo sobrenadante ou a cada poço (uso completo TCM para transfeccao simulado). Etiquete cada bem como para a adição de retrovírus ou mídia simulada. Centrifugar as placas a 1200 x g durante 30 min à temperatura ambiente. Enquanto as placas estão girando, coletar células T ativadas e contar usando um hemocytometer. Transdução é realizada com 5 x 106 ativado splenocytes num total de 5 mL/poço. Granule o número necessário de splenocytes para simulação/transdução em tubos separados por centrifugação a 500 x g durante 5 min. Re-suspenda splenocytes em uma densidade de 5 x 106 células por 2,5 mL de filtrado retrovírus contendo sobrenadante da etapa 2.6.4 ou TCM como controlo negativo. Adicione Il-2 humana recombinante (LIS-2) e o rato recombinante IL-7 (mIL-7) a uma concentração final de 200 UI/mL e 4 ng/mL respectivamente. Coletar as placas 6-poços de centrífuga após a conclusão da etapa 2.6.5 e adicione 2,5 mL/bem re-suspensos splenocytes em poços apropriados para fazer um volume final de 5 mL/bem e uma concentração final de 100 U/mL hIL-2 e 2 ng/mL. o mIL-7. Centrifugar as placas a 1200 x g, durante 90 min à temperatura ambiente. Após a centrifugação, Incube as placas a 37 ° C, 5% CO2 durante a noite. Dia 5: Round 2 de transdução Recolha o fragmento recombinante humano fibronectina das placas como este pode ser re-utilizada. Repita os passos de 2.6.2 – 2.6.5. Enquanto as placas estão girando, colete células de 1st redondo de transdução usando uma pipeta Pasteur. Enxágue a cada poço com 2 mL de PBS, redemoinho e coletar as células restantes em cada poço.Nota: Pipete para cima e para baixo re-suspender as células sedimentadas. Recolha cada grupo controle/transdução em tubos separados. Tubos de centrífuga a 500 x g durante 5 min. Ressuspender as células em 2,5 mL por poço de transdução com 200 UI/mL IL-2 e IL-7 de 4 ng/mL. Repita as etapas 2.6.7 – 2.6.8. Remover células da centrífuga e incubar a 37 ° C, 5% de CO2 para células de 4 h. recolher transfectadas como em etapas 2.7.2-2.7.3. Contar as células, centrifugar a 500 x g por 5 min e ressuspender em TCM completa em uma densidade de 1 x 106 células/mL, com 100 U/mL hIL-2 e 2ng/mL mIL-7. Transferir para um balão de tamanho adequadamente cultura e incubar a 37 ° C, 5% de CO2. Adicionar mídia TCM fresca contendo 100U/mL hIL-2 e 2ng/mL mIL-7 cada 2 dias, mantendo uma densidade de células de 1 x 106 células/mL.Nota: Splenocytes colhidos contêm uma variedade de tipos de células. Sob essas condições de cultura, as células T não morrem ao longo de 2-3 dias. Depois de ~ 4 dias em cultura de células, o número de células T é normalmente equivalente ao número total de splenocytes colhidos no dia 0. 3. medição da eficiência de transdução Na transdução de post do dia 4, colete uma amostra de células T transduzidas ou não-transfectadas (aproximadamente 3 x 105 células). Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 500 x g por 5 min, desprezar o sobrenadante, lavar as células peletizadas uma vez com PBS e centrifugar novamente. Desprezar o sobrenadante e adicionar 100 μL de PBS contendo uma amina apropriado tintura reactiva (por exemplo, mancha ao vivo/morto, diluição de 1 em 100) por poço. Incube durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. Lave duas vezes com PBS e centrifugar a 500 x g, durante 5 min. descartar o sobrenadante e incubar com 50 μL de tampão de FACS contendo anticorpos CD16/CD32 anti-rato receptor Fc bloqueio (diluição de 1 em 100). Incubar durante 10 minutos a 4 ° C. Diretamente adicione 50 μL do anticorpo que mancha mestre mistura contendo anti-rato BV786-CD4 e CD8-BV711 anticorpos (concentração final de 1 μL/poço no buffer de FACS). Incube durante 30 min a 4 ° C, no escuro. Repita a etapa de lavagem 3.3. Ressuspender as células em buffer PFA de 1% e manter no escuro a 4 ° C até análise por citometria de fluxo. Analise as células com equivalente citômetro apropriado usando BV711, BV785 e mCherry de fluorescência como marcadores de subconjunto de CD4 e CD8 e expressão de carro gating respectivamente como em (Figura 2). 4. in vitro células de validação de carro T atividade Sementes syngeneic alvo CD19+ células de tumor com ou sem expressão do luciferase em uma densidade de 1 x 104 células em 100 μL TCM/bem em um U-fundo de 96 poços placa de cultura de tecidos. Adicione 1 x 104 CD19 carro T células/poço em um volume de 100 μL/poço para alcançar um efetor à relação de destino (E:T) de 1:1.Nota: Rácios de E:T devem ser estabelecidos para cada carro construir e linhagem de células-alvo. Uso T células sozinho e sozinho como controles negativos de células tumorais e as células T estimuladas por phorbol myristate-acetato (PMA) (50 ng/mL) e ionomycin (1 μg/mL) como controle positivo para liberação de Interferon gama (relato). Células de cultura co a 37 ° C, 5% de CO2 para 16-24 h. Após co-cultura, Centrifugar as placas a 500 x g por 5 min e recolher o sobrenadante para posterior análise de relato e ELISA de IL – 12 p 70.Nota: Isso pode ser armazenado a-80 ° C. Re-suspenda pelotas de célula em 100 µ l de PBS contendo luciferina (concentração final de 1,5 mg/mL). Incubar as placas durante 10 minutos a 37 ° C. Em seguida medir a luminescência de cada poço com um apropriado luminómetro.Nota: Tempos de exposição devem ser otimizados para densidade e linhas celulares. Resultados representativos são mostrados na Figura 3a. Ex-vivo citotoxicidade das células T de carro pode ser modificada para luciferina expressa por co-cultura com linhagens celulares expressando o antígeno alvo. Células T de carro matam células-alvo, luciferina é liberada, portanto uma redução no sinal de luminometry está correlacionada com a morte celular. Células transfectadas non muitas vezes podem ter um efeito sobre a viabilidade da célula alvo, particularmente durante períodos de incubação longos. Medir a concentração de murino relato e IL – 12p 70 no sobrenadante de acordo com protocolos de ELISA do fabricante. Resultados representativos são mostrados na (Figura 3b e 3C). Ex-vivo ativação de células T de carro por co-cultura com linhagens celulares expressando o antígeno alvo pode ser analisada através da análise de conteúdo sobrenadante usando ELISA. A proporção de células T de carro para células-alvo e duração do período de co-cultura devem ser otimizados para cada carro construção, linha de célula de destino e analito. Tratamento de PMA e ionomycin pode ser usado como um controle positivo para confirmar a qualidade de células T e sua capacidade de responder. 5. avaliar a atividade anti-câncer em ratos Protocolo n º 1 Realize 100 mg/kg por via intravenosa (IV) entrega ciclofosfamida em camundongos BALB/c de 6 a 8 semanas. Isso permite que a enxertia de tumor sem significativa lymphodepletion17 (Figura 4).Nota: Que institui A20 linfoma pode levar mais de 2 meses com uma taxa de tomar suboptimal. Isso pode ser melhorado através da utilização de ciclofosfamida 1 dia antes da entrega das células do linfoma. A fim de estudar os ratos lymphoreplete, identificamos uma dose de ciclofosfamida que pode aumentar a eficiência de linfoma sem causar lymphodepletion. No dia seguinte, injete 100 µ l de 5 x 105 syngeneic A20 células B linfoma células modificadas para expressar a proteína luciferase e verde fluorescente (GFP) em ratos por injeção intravenosa (IV). Permitir que os ratos desenvolver linfoma sistêmica para ~ 17 dias. Confirme a presença de linfoma sistêmica por injeção intraperitoneal de (IP) de 100 μL de Luciferina de 30 mg/mL e de imagem usando uma bioluminescência na vivo , sistema de imagem. Use separadores para evitar repercussões de sinal em camundongos adjacentes. Expor a ratos durante 1 min no lado ventral com uma região de tamanho constante de interesse. Exibir unidades de luz relativas (RLU) como fótons por segundo (p/s). As configurações devem ser otimizadas para cada modelo de tumor; Use uma exposição que pode pegar a deteção adiantada de tumores, mas não leva à saturação como tumores atingir pontos de extremidade. Registro RLU total para cada mouse com uma constante de porte região de interesse. (Figura 5a e b). Injete um linfoma de dose única de 1 x 106 células T de carro por injeção IV em camundongos lymphoreplete tendo estabelecido.Nota: (importante) Níveis de dosagem deve ser estabelecido para cada carro construir usando um cronograma de escalonamento de dose para garantir que quaisquer possíveis toxicidades decorrentes de células T de carro são caracterizadas e podem ser abordadas. Apesar de células de anti-rato CD19 carro T não exibir toxicidades, células T de carro podem dar origem a toxicidade inesperada. Onde várias construções de carro e eficiências de transdução não são idênticas, o número total de células T administrado deve ser mantido igual pela adição das células T não-transformados em preparações da pilha. Monitorar a progressão da doença semanalmente através da injeção de IP de 100 μL de Luciferina de 30 mg/mL e de imagem usando uma bioluminescência na vivo de imagem de sistema (Figura 5C). Estreitamente monitorar camundongos para sinais de toxicidade e a eutanásia em algum rato que mostram os primeiros sinais de paralisia de membro posterior (HLP) ou carga patológica do tumor antes de qualquer sofrimento pode surgir.Nota: Toxicidades de A20 linfoma podem incluir paralisia do membro posterior através de invasão do tumor das meninges. Verifique regularmente se os primeiros sinais de alteração da marcha. Da mesma forma, grandes tumores IP podem surgir que pode levar a desconforto demonstrado pelo comportamento alterado. Monitorar a sobrevivência dos ratos por 60-100 dias (Figura 5D). Realizar eutanásia por um método de programação-1 após a conclusão do experimento. Protocolo 2 Entrega da ciclofosfamida 200 mg/kg de 6 a 8 – semana velhos camundongos BALB/c por cauda veia injeção de 100 µ l de PBS por rato. No dia seguinte, injete de 5 x 105 syngeneic A20 células B linfoma células expressando luciferase e GFP em 100 μL PBS através de cauda veia injeção. Permitir que os ratos desenvolver linfomas sistêmicos para ~ 7-14 dias Confirme o linfoma sistêmica por injeção de IP de 100 μL de Luciferina de 30 mg/mL e de imagem usando uma bioluminescência na vivo , sistema de imagem. Realize 5 Gy irradiação total do corpo (TBI) 0,02 Gy/min para lymphodepletion.Nota: Pacientes submetidos a tratamentos de célula T carro passam por uma série de regimes para alcançar lymphodepletion, antes que a administração de células T de carro que aumenta significativamente a enxertia de enviaram transferido células T de carro. Isto pode ser replicado em camundongos com irradiação de corpo total (TBI) (Figura 6). No dia seguinte, Injete 1 x 106 células T de carro em 100 μL de PBS através de cauda veia injeção em ratos tendo estabelecida tumores. Colete sangue amostras através de cauda veia sangra após 7 dias. Adicione o tampão de lise de eritrócitos para cada amostra de sangue e, em seguida, prepare-se para citometria de fluxo, conforme descrito na seção 3. Analise a persistência de célula T de carro na circulação por citometria de fluxo (Figura 2).Nota: Adição de grânulos contando imediatamente antes da citometria permite a determinação do número de células T de carro por mililitro de sangue. Monitorar o progresso da doença conforme descrito nas etapas 5.1.5 – 5.1.8 (Figura 7).