Burada, üretim ve retroviral iletim ve kullanımı karşı kurulan syngeneic A20 B hücreli lenfoma veya lymphodepleting olmadan BALB/c farelerde tedavi olarak fare CD19 araba T hücrelerinin önceden klinik test için bir iletişim kuralı mevcut önceden Klima.
CD19 chimeric antijen reseptör (araba) T-hücre tedavisi şaşırtıcı klinik başarı iki ikinci nesil chimeric antijen reseptör (CARs) onayı ile akut lenfoblastik lösemi (ALL) andnon-Hodgkin Lenfoma (NHL) açmıştır. Alanın odak şimdi nerede daha az etkileyici tam yanıt oranları gözlenmektedir diğer hematolojik maligniteler bu başarılar taklit olduğunu. Daha fazla araba T hücreleri veya diğer tedavi şekilleri, iş yönetimi mühendislik başarıyla diğer kanser ayarları başarılı tedavi için engelleri aşmak.
Bu yüzden hangi-ebilmek davranış diğerleri CD19 araba T hücrelerinin önceden klinik test modeli mevcut. Bu iyi test B hücreli lenfoma model sonuçlarında bilgilendirici araba T-hücre tedavisi genel olarak etkilenebilir.
Bu iletişim kuralı kalsiyum fosfat transfection Plat-E yapımcı hücre MP71 retroviral yapıları ve pCL-Eco ambalaj plazmid salgılanan retroviral parçacıklar topluluğu tarafından takip ile araba T hücreleri fare tekrarlanabilir üretimi sağlar ve Rekombinant insan fibronektin parçası ve Santrifüjü kullanarak hedefidirler. Retroviral hedefidirler geçerliliğini ve hedef lenfoma hücreleri ex vivo, akış sitometresi, luminometry ve enzim bağlı immunosorbent kullanılarak öldürmek için yetenek araba T hücrelerinin onay assay (ELISA), ayrıca tanımlanmaktadır.
Araba T testleri için protokolleri hücreleri vivo içinde lymphoreplete ve lymphodepleted syngeneic fareler, kurulan, sistemik lenfoma taşıyan açıklanmıştır. Anti-kanser faaliyet içinde vivo bioluminescence ve hastalık ilerleme tarafından izlenir. Biz tipik sonuçları giderme kurulan B hücreli lenfoma 1st veya 2nd üretimi arabalar lymphodepleting öncesi klima ve araba T kullanan zaman uzun süreli remisyon elde fareler bir azınlık ile birlikte kullanan göstermek IL-12 lymphoreplete farelerde ifade hücreleri.
Bu protokoller CD19 araba T hücreleri farklı ek değişiklik, araba T hücrelerinin kombinasyonları ve diğer terapötik ajanlar ile değerlendirmek için kullanılan ya da farklı hedef antijenlere karşı araba T hücreleri kullanımı için uyarlanmış.
Chimeric antijen reseptör (araba) T-hücre tedavisi CD19 tedavisinde şaşırtıcı klinik başarı göstermiştir+ tisagenlecleucel Relaps Akut lenfoblastik lösemi1 ve axicabtagene için onaylanması için önde gelen maligniteler ciloleucel ilerici büyük B hücreli non-Hodgkin Lenfoma için2 2017.
Kanser ve bağışıklık sistemi hastalığı ilerleme ve tedavi mekanizmaları arasındaki etkileşimler önemi giderek tanınan3,4,hale geliyor5. Örneğin, iyi tümör microenvironment (TME) suda yüzen bağışıklık hücreleri6,7,8efektör fonksiyonları önleyebilirsiniz faktörleriyle olduğu belgelenmiştir. Alternatif olarak astar endojen bağışıklık hücreleri ve epitope yayılan tümör ortadan kaldırılması ve uzun vadeli direnci tümör meydan9,10anahtar olabilir. Bu olayların her ikisi de bir bağışıklık sistemi eksikliği xenogeneic modellerinde değerlendirilemez. Aynı şekilde, transgenik proteinler kullanan sistemleri11,12yayılan epitope için gerekli olan bağışıklık toleransı kırma meydan doğru bir şekilde yansıtmıyor. Syngeneic manken tamamen işlevsel bir bağışıklık sistemi, bu nedenle, kanser hastalığı ilerleme ve bağışıklık tedavi bu önemli yönleri modelleme için her şeyden önemlidir.
Araba T-hücre tedavisinin önemli bir uyarı lymphodepleting öncesi Klima tedavi başarı13,14için gerekli olmasıdır. Bu genellikle hastalarda infüzyon araba T hücreleri15,16önce kemoterapi yönetmek olarak elde edilir. Standart bir yöntem, hasta ayarlarında kullanılan lymphodepletion taklit etmek için bizi 5 Gy tüm vücuda radyasyon vermeliyiz (TBY) lymphodepletion sistemik A20 B hücreli lenfoma taşıyan fareler için tedavi edici araba T hücrelerinin yönetim önce ulaşmak için yönetmek.
Lymphodepleting öncesi Klima hastaların çoğu için bir sorun olmasa da, kemoterapötik ajanlar ile gelir toksisitesi düşük performans durumu hastaların araba T-hücre tedavisi için uygun değildir anlamına gelir. Lymphodepletion için uygun olmayan hastalar temsil eden bir test sistemi oluşturmak için hangi biz araba T-hücre tedavisi lenfoma model bir lymphoreplete syngeneic fare modeli kurduk. Bu modelde, biz IL-12 den salgı araba T hücreleri içinde kurulan lenfoma eradikasyonu ile başarı oranı neden olabilir gösterdi ~ % 2517. Ayrıca, endojen bağışıklık hücreleri kanser eradikasyonu dahil gösterdi.
Burada biz ayrıntılı olarak fare araba T hücrelerinin üretimi için protokol syngeneic fareler ve araba T hücreleri ile veya lymphodepleting öncesi Klima kullanımı olmadan lenfoma tedavisinde lenfoma kurulması tarif. Bu araba T hücreleri ile diğer transgenes test diğer ajanlar ile araba T hücrelerinin kombinasyonu etütler veya diğer evlat edinen hücre terapisi ya da immünoterapi stratejileri lenfoma karşı kullanımı için kullanılabilir.
Syngeneic fare modelleri hastalık ilerleme ve terapi test sağlam bir bağışıklık sistemi koruyarak sağlar. Bağışıklık sistemi ve özellikle immunotherapeutic maddeleri için etkileşim tedaviler gelince bu her şeyden önemlidir.
Burada açıklanan protokol iki kritik iş akışı var., ilkini genetik olarak fare T hücre arabalar hızlı değiştirme. Bu başlangıç itibaren 7 gün iletim doğrulama gerektirir. Farelerde sistemik lenfoma araba T hücrelerinin üretimi ile eşlik eden bir tesistir. Araba T hücre üretim başarısız veya kalite varlık genellikle fareler önce yedek hücreleri üretmek için yeterince zaman kalmadı yetersiz Lenfoma için ölmek gerekir. Bu nedenle araştırmacılar bu modeller doğru bir şekilde kullanarak başarılı bir şekilde tedavi yönetimi için araba T hücrelerinin üretimini zaman için tümör dozaj ve hastalık ilerleme çalışmaları gerçekleştirmek çok önemlidir.
Düşük T-hücre iletim verimliliği için tipik nedenleri yapımcı hücreleri, genellikle yoksul plazmid saflık ya da yanlış transfection ortam pH tayini neden zavallı transfection verimliliğini içerir. Bu zavallı transfection T hücre iletim verimliliği sınırlar gibi tam protokolü ile devam etmeden önce yapımcı hücre transfection verimliliğini kontrol etmek için tavsiye edilir. Rekombinant insan fibronektin parçaları toplanabilir ve -20 ° c yeniden kullanmak, ancak, birden çok donma-thaws sonucunda düşük iletim verimliliği depolanan. Koleksiyonu da yüksek almak için önemlidir sonra fare dalağı hızlı işleme uygun T hücrelerinin verir.
Burada açıklanan protokol A20 hücre luciferase ifade kullanır belirtmek gerekir. Sistemik tümör yükünü bioluminescence görüntüleme tarafından ölçmek için yeteneği sağlar bu tercih edilir. Ancak, işlevsel bir bağışıklık sistemi huzurunda luciferase yanıt sonuçları çarpık. Fare işaretçisi transgenes17hayatta kalma bağışıklık tepkileri daha önce test ettik. Bunu doğrulamak için A20 hücre transgenes ücretsiz kullanarak anahtar deneyler çoğaltmak için o bunlar bağışıklık hücreleri tarafından tümör imha içinde önemli bir rol oynamak yok anahtarıdır.
Klinik ajanlar-ebilmek biricik var olmak kullanılmış içinde vivo bağışıklık eksikliği farelerde iken fare araba T hücreleri fare kanser hücrelerine karşı kullanımı tedavi edici etkinliği veya hastalık ilerlemesi için bağışıklık sisteminin katkıları değerlendirmek için bize izin verir. Bu iletişim kuralı B hücreli lenfoma veya diğer arabalar salgı IL-12 burada açıklandığı gibi ek değişiklikler ile hedefleme arabalar önceden klinik değerlendirilmesi için yararlanılabilir. Bu bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimi syngeneic fare modellerinde değerlendirilebilir olmasına rağmen onlar doğru insanlar içinde vivoetkileşiminde özetlemek değil olduğunu belirtmek gerekir. Özellikle dikkat, insan ve fare araba hangi aşağı akım sonuçlara yol açabilir yapısında değişiklik gösterir; T hücrelerinin büyüme için uygun harekete geçirmek ve hücre kültür koşulları farklı20, doku dağıtım hedef antijen ifade insanlar ve fareler arasında değişiklik gösterebilir ve deneyimli toksisitesine kökten farklı olabilir. Bu nedenle ex vivo ve sonuçları teyit için xenogeneic modelleri kullanmak esastır.
Özet olarak, syngeneic lymphodepleted ve lymphoreplete modeli lenfoma hastaları ve önceki kemoterapi/radyoterapi olmadan özetlemek. Bu hangi ile yeni bağışıklık terapisi ajanların dalga önümüzdeki önemli olacaktır tedavi stratejileri bir dizi test izin vermek için klinik ayarları taklit etmek bir model sistemi sağlar.
Ön Klima kullanımı ile tüm fareler genellikle lenf kanserini temizleyin belirtilecektir. Kadar % 90 tam yanıt oranları, insanlarda bu temsilcisi etmektir. Ancak, sorunlar CD19 araba T-hücre tedavisi için çabaladıkça gözlenen yüksek frekans önlenmesi üzerinde menteşe çoğu zaman CD19 vardır. Çabaladıkça bu modelde en fazla ve genellikle 100 günden fazla gözlenmiştir değil. Değişiklik klinikte görülen çabaladıkça taklit CD19 araba T-hücre tedavisi gelecekteki sorunları ile yardımcı olabilir.
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırma (grant 13031) ve bu eser desteklemek için CRUK Manchester biyolojik kaynak birimi, görüntüleme ve Sitometresi ve moleküler biyoloji core imkanları finansman için Bloodwise teşekkür etmek istiyorum.
0.2 µm syringe filter | Appleton Woods | FC121 | |
0.45 µm syringe filter | Appleton Woods | FC122 | |
1.5ml pestle and microtube | VWR | 431-0098 | |
100X penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Gibco | 10378016 | |
2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350–010 | |
Blasticidine S hydrochloride | Sigma- Aldrich | 15205 | |
Bottle Top Filter (0.2 µm) | Scientific Laboratory Supplies | FIL8192 | |
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100759 | 1 in 100 staining dilution. Clone 53-6.7 |
Brilliant Violet 785 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100552 | 1 in 100 staining dilution. Clone RM4-5 |
Calcium chloride dihydrate | Sigma- Aldrich | C7902 | |
Cell counting beads – CountBright absolute counting beads | Molecular Probes | C36950 | |
Cell Strainer 100μm | VWR | 734-0004 | |
Cyclophosphamide Monohydrate | Merck | 239785-1GM | |
Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) – High Glucose | Sigma Aldrich | D6546 | |
Dynabeads | Gibco | 11131D | |
Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | GE17-1440-03 | Sold by Sigma- Aldrich |
Flow cytometer – LSR Fortessa x20 | BD Biosciences | 658222R1 | |
Foetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
Haemacytometer | Appleton Woods | HC001 | |
HEPES solution | Sigma- Aldrich | H0887 | |
IL-12 p70 Mouse Uncoated ELISA Kit | Invitrogen | 88-7121-76 | |
IL2, Proleukin | Novartis | PL 00101/0936 | |
in vivo bioluminescence imaging system – in vivo xtreme II imaging system | Bruker | T149094 | |
Ionomycin Calcium Salt | Sigma- Aldrich | I0634 | |
Live/dead stain – Zombie Violet Fixable Viability Kit | BioLegend | 423114 | 1 in 100 staining dilution |
Luminometer – Lumistart Omega | BMG Labtech | 415-301 | |
Murine IFN-γ ELISA kit | Diaclone | 861.050.010 | |
Paraformaldehyde | Sigma- Aldrich | 16005 | |
pCL-Eco | Novus Biologicals | NBP229540 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma- Aldrich | P8139 | |
Platinum E cell line | Cell Biolabs | RV-101 | (RRID:CVCL_B488) |
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | Clone 37.51 |
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3ε | BD Biosciences | 553057 | Clone 145-2C11 |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | 1 in 100 staining dilution. Clone 2.4G2 |
Puromycin Dihydrochloride | Sigma- Aldrich | P8833 | |
Recombinant human fibronectin fragment – RetroNectin Reagent | TaKaRa | T100B | |
Recombinant Mouse IL-7 (carrier-free) | BioLegend | 577806 | |
Red cell lysis buffer | eBioscience | 004-4333-57 | |
RPMI 1640 Medium | Lonza | BE12-167F | |
Trypsin – EDTA solution | Sigma- Aldrich | T3924 | |
XenoLight D-Luciferin | Perkin Elmer | 122799 |