Um método automatizado para determinar o desempenho de Drosophila em resposta às mudanças de temperatura no espaço e no tempo
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para determinar automaticamente o desempenho locomotor de Drosophila em mudança de temperaturas usando uma arena programável de temperatura controlada que produz mudanças de temperatura rápidas e precisas no tempo e no espaço.
Abstract
A temperatura é um fator ambiental onipresente que afeta como espécie distribuir e se comportar. Diferentes espécies de moscas de fruta Drosophila tem respostas específicas às mudanças de temperaturas, de acordo com sua tolerância fisiológica e adaptabilidade. Drosófila moscas também possuem uma sistema que se tornou fundamental para entender a base neural da temperatura de processamento na aditividade de sensores de temperatura. Apresentamos aqui uma arena de temperatura controlada que permite mudanças de temperatura rápida e precisa com controle temporal e espacial para explorar a resposta de moscas individuais às mudanças de temperaturas. Moscas individuais são colocadas na arena e expostas aos desafios de temperatura pré-programada, tais como uniforme gradual aumenta de temperatura a determinar normas de reação ou temperaturas espacialmente distribuídas ao mesmo tempo para determinar as preferências. Os indivíduos são controlados automaticamente, permitindo a quantificação da velocidade ou local de preferência. Esse método pode ser usado para quantificar rapidamente a resposta sobre uma vasta gama de temperaturas para determinar as curvas de desempenho de temperatura em Drosophila ou outros insetos de tamanho similar. Além disso, pode ser usada para estudos genéticos para quantificar a temperatura preferências e reações de mutantes ou selvagem-tipo moscas. Esse método pode ajudar a descobrir a base da especiação térmica e adaptação, bem como os mecanismos neurais subjacentes processamento de temperatura.
Introduction
A temperatura é um factor ambiental constante que afeta como organismos funcionam e se comportar1. As diferenças de latitude e altitude levam a diferenças no tipo de climas organismo são expostos, que resulta na seleção evolutiva para suas respostas a temperatura2,3. Os organismos respondem a temperaturas diferentes, através de adaptações morfológicas, fisiológicas e comportamentais que maximizar o desempenho sob seus determinados ambientes4. Por exemplo, na mosca da fruta Drosophila melanogaster, populações de diferentes regiões têm preferências de temperatura diferentes, tamanhos de corpo, vezes no desenvolvimento, longevidade, fecundidade e ambulante de desempenho em temperaturas diferentes2 ,5,6,7. A diversidade observada entre moscas de diferentes origens é explicada em parte pela variação genética e expressão de gene plástico8,9. Da mesma forma, espécies de Drosophila , de diferentes áreas distribuem diferentemente entre gradientes de temperatura e mostram as diferenças na resistência a calor extremo e frio testes10,11,12.
Drosófila recentemente também se tornou o modelo de escolha para entender a base genética e neural de temperatura percepção13,14,15,16,17. Em geral, moscas adultas percebem a temperatura através de sensores de temperatura periférica quentes e frias nas antenas e sensores de temperatura no cérebro14,13,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20. os receptores da periferia para temperaturas quentes expressam Gr28b.d16 ou pirexia21, enquanto a periferia frios receptores são caracterizados por Brivido14. No cérebro, a temperatura é processada por neurônios expressando TrpA115. Estudos comportamentais em mutantes destas vias estão a melhorar a nossa compreensão de como a temperatura é processada e dar insights sobre mecanismos que variam entre as populações de Drosophila de diferentes regiões.
Aqui nós descrevemos uma arena de temperatura controlada que produz mudanças de temperatura rápida e precisa. Investigadores podem pré-programar estas mudanças, o que permite manipulações de temperatura padronizados e repetíveis, sem intervenção humana. Moscas são registradas e controladas com software especializado para determinar sua posição e velocidade em diferentes fases de uma experiência. A principal medida apresentada neste protocolo é a velocidade ambulante em temperaturas diferentes, porque é um índice ecologicamente relevante de desempenho fisiológico que pode identificar a adaptabilidade individual térmico5. Juntamente com os mutantes do receptor de temperatura, esta técnica pode ajudar a revelar os mecanismos de adaptação térmica nível celular e bioquímico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui nós apresentamos uma automatizado controlado por temperatura arena (Figura 1) que produz alterações de temperatura preciso no tempo e no espaço. Esse método permite que a exposição de individuais drosófila não só para pré-programados aumentos graduais de temperatura (Figura 2 e Figura 3), mas também aos desafios de temperatura dinâmica em que cada telha da arena voar era aquecida independentemente a uma te…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado em parte por uma bolsa de estudos da Behavioural e programa de neurociência cognitiva da Universidade de Groningen e uma bolsa de estudos de pós-graduação do Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) do México, concedida a Andrea Soto-Padilla e uma doação da Fundação John Templeton, para o estudo de tempo atribuído a Hedderik van Rijn e Jean-Christophe Billeter. Nós também somos gratos a Peter Gerrit Bosma por sua participação no desenvolvimento do rastreador de FlySteps .
Scripts TemperaturePhases, FlySteps e FlyStepAnalysis podem ser encontrado como informação suplementar e no seguinte link temporário e publicamente disponível:
https://dataverse.nl/privateurl.xhtml?token=c70159ad-4d92-443d-8946-974140d2cb78
Materials
| Arduino Due | Arduino | A000062 | Software RUG |
| Electronics Board | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-Main-02-2014 | |
| Power supply Boost | XP-Power 48. V 65 W | ECS65US48 | Set to 53 Volt |
| Power supply Tile Heating | XP-Power 15. V 80 W | VFT80US15 | |
| Power supply Cooling | XP-Power 15. V 130 W | ECS130U515 | |
| Peltier elements | Marlow Industries | RC12-4 | 2 Elements, controlled DC feed |
| Heat sink | Fisher Technik | LA 9/150-230V | Decoupled for vibration |
| Temperature sensors | Measurement Specialties | MCD_10K3MCD1 | Micro Thermistor Probe |
| Copper block/tiles | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-CB-01-2014 | |
| Auminum ring | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-RoF-02-2015 | |
| Tesa 4104 white tape 25 x 66 mm | RS Components | 111-2300 | White conductive tape |
| Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
| Warm white LED strip | Ledstripkoning | HQ-3528-SMD | 60 LEDs per meter |
| Switch Power Supply | Generic | T-36-12 | |
| Logitech c920 | Logitech Europe S.A | PN960-001055 | |
| QuickTime Player | Apple Computer | Recording program | |
| Tracking analysis software | R | Packages: pacman | |
| Tracking analysis software | MATLAB | ||
| Thermal Imaging | FLIR T400sc | ||
| Graphs and Statisticts Software | Graph Pad Prism | ||
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | Siliconising agent |
| Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
| Flypad | Flystuff | 59-114 | |
| Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25×95 mm |
| Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
| Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
| Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
| Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
| Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
| Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
| Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
| Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
| Molasses | Flystuff | 62-117 | |
| Active dry yeast | Red Star | ||
| Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
Referências
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