Un metodo automatizzato per determinare le prestazioni della drosofila in risposta a variazioni di temperatura nello spazio e nel tempo
Summary
Qui presentiamo un protocollo per determinare automaticamente le prestazioni dell’apparato locomotore di Drosophila alle variazioni di temperatura usando un arena di temperatura programmabile che produce i cambiamenti di temperatura veloce ed accurato nel tempo e nello spazio.
Abstract
Temperatura è un fattore ambientale onnipresente che colpisce come specie distribuire e comportarsi. Diverse specie di mosche della frutta Drosophila hanno risposte specifiche alla variazione della temperatura secondo la loro tolleranza fisiologica e adattabilità. Drosofila mosche possiedono anche un sistema che è diventata fondamentale per comprendere le basi neurali della temperatura di lavorazione in ectotermi di rilevamento della temperatura. Presentiamo qui una arena temperatura controllata che consente cambi di temperatura veloce e preciso controllo temporale e spaziale per studiare la risposta di singoli mosche a temperature variabili. Mosche individuali sono collocati nell’arena ed esposti alle sfide di temperatura pre-programmati, come uniforme graduale aumenta di temperatura per determinare norme di reazione o temperature spazialmente distribuite allo stesso tempo di determinare le preferenze. Gli individui vengono monitorati automaticamente, consentendo la quantificazione della velocità o posizione di preferenza. Questo metodo può essere utilizzato per quantificare rapidamente la risposta sopra un ampio range di temperature per determinare le curve di prestazione di temperatura in Drosophila o altri insetti di dimensioni simili. Inoltre, può essere utilizzato per studi genetici di quantificare le preferenze di temperatura e reazioni di mutanti o selvaggio-tipo mosche. Questo metodo può aiutare a scoprire la base della speciazione termica e adattamento, come pure i meccanismi neurali dietro lavorazione temperatura.
Introduction
Temperatura è un fattore ambientale costante che colpisce come organismi funzionano e comportano1. Le differenze in latitudine e altitudine portano a differenze nel tipo di climi organismo sono esposti, che si traduce in selezione evolutiva per le loro risposte a temperatura2,3. Gli organismi rispondono a diverse temperature attraverso adattamenti morfologici, fisiologici e comportamentali che massimizzano le prestazioni sotto loro particolari ambienti4. Per esempio, nel moscerino della frutta Drosophila melanogaster, popolazioni provenienti da diverse regioni hanno preferenze diverse temperatura, dimensioni del corpo, volte inerente allo sviluppo, longevità, fecondità e prestazioni a piedi a diverse temperature2 ,5,6,7. La diversità osservata tra mosche di diverse provenienze si spiega in parte con variazione genetica ed espressione genica plastica8,9. Allo stesso modo, specie di Drosophila provenienti da diverse aree distribuire in modo diverso tra i gradienti di temperatura e mostrare le differenze nella resistenza a calore estremo e freddo test10,11,12.
Drosophila anche recentemente è diventato il modello di scelta per comprendere le basi genetiche e neurali della temperatura percezione13,14,15,16,17. In generale, mosche adulte percepiscono temperatura mediante sensori di temperatura periferica caldi e freddi nelle antenne e sensori di temperatura nel cervello13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20. i recettori di periferia per alte temperature express Gr28b.d16 o piressia21, mentre la periferia freddi recettori sono caratterizzati da Brivido14. Nel cervello, la temperatura viene elaborato dai neuroni che esprimono TrpA115. Studi comportamentali su mutanti di queste vie sono migliorare la nostra comprensione di come la temperatura viene elaborato e dare spunti nei meccanismi che variano fra le popolazioni di Drosophila da diverse regioni.
Qui descriviamo una arena temperatura controllata che produce i cambiamenti di temperatura veloce e preciso. Gli investigatori possono pre-programmare questi cambiamenti, che consente per le manipolazioni di temperatura standardizzata e ripetibile senza intervento umano. Mosche sono registrati e monitorati con software specializzato per determinarne la posizione e la velocità nelle diverse fasi di un esperimento. La misura principale presentata in questo protocollo è la velocità di camminata a diverse temperature, perché è un indice ecologicamente rilevante di prestazione fisiologica che possa identificare adattabilità individuale termico5. Insieme a mutanti del recettore di temperatura, questa tecnica può aiutare a rivelare i meccanismi di adattamento termico a livello cellulare e biochimico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui abbiamo presentato un’arena automatizzata temperatura controllata (Figura 1) che produce i cambiamenti di temperatura preciso nel tempo e nello spazio. Questo metodo permette l’esposizione di singoli Drosophila non solo pre-programmati aumento graduale della temperatura (Figura 2 e Figura 3), ma anche a sfide di temperatura dinamico in cui ogni mattonelle dell’arena Vola era riscaldata in modo indipendente ad una temper…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una borsa di studio dalla comportamentali e Cognitive Neuroscience programma dell’Università di Groningen e una borsa di studio laureato il Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) dal Messico, concesso a Andrea Soto-Padilla e una borsa di studio della John Templeton Foundation per lo studio del tempo assegnato a Hedderik van Rijn e Jean-Christophe Billeter. Siamo inoltre grati a Peter Gerrit Bosma per la sua partecipazione nello sviluppo il tracker di FlySteps .
Script TemperaturePhases, FlySteps e FlyStepAnalysis può essere trovato come informazione supplementare e nel seguente link temporaneo e pubblicamente disponibili:
https://dataverse.nl/privateurl.XHTML?token=c70159ad-4d92-443D-8946-974140d2cb78
Materials
| Arduino Due | Arduino | A000062 | Software RUG |
| Electronics Board | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-Main-02-2014 | |
| Power supply Boost | XP-Power 48. V 65 W | ECS65US48 | Set to 53 Volt |
| Power supply Tile Heating | XP-Power 15. V 80 W | VFT80US15 | |
| Power supply Cooling | XP-Power 15. V 130 W | ECS130U515 | |
| Peltier elements | Marlow Industries | RC12-4 | 2 Elements, controlled DC feed |
| Heat sink | Fisher Technik | LA 9/150-230V | Decoupled for vibration |
| Temperature sensors | Measurement Specialties | MCD_10K3MCD1 | Micro Thermistor Probe |
| Copper block/tiles | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-CB-01-2014 | |
| Auminum ring | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-RoF-02-2015 | |
| Tesa 4104 white tape 25 x 66 mm | RS Components | 111-2300 | White conductive tape |
| Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
| Warm white LED strip | Ledstripkoning | HQ-3528-SMD | 60 LEDs per meter |
| Switch Power Supply | Generic | T-36-12 | |
| Logitech c920 | Logitech Europe S.A | PN960-001055 | |
| QuickTime Player | Apple Computer | Recording program | |
| Tracking analysis software | R | Packages: pacman | |
| Tracking analysis software | MATLAB | ||
| Thermal Imaging | FLIR T400sc | ||
| Graphs and Statisticts Software | Graph Pad Prism | ||
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | Siliconising agent |
| Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
| Flypad | Flystuff | 59-114 | |
| Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25×95 mm |
| Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
| Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
| Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
| Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
| Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
| Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
| Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
| Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
| Molasses | Flystuff | 62-117 | |
| Active dry yeast | Red Star | ||
| Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
Referências
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