En automatisert metode for å avgjøre ytelsen til Drosophila svar temperaturendringer i rom og tid
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å automatisk avgjøre Drosophila locomotor ytelse på skiftende temperaturer bruker en programmerbar temperatur-kontrollerte arena som gir rask og nøyaktig temperaturendringer i tid og rom.
Abstract
Temperaturen er en allestedsnærværende miljømessige faktoren som påvirker hvordan arter distribuere og oppfører seg. Ulike arter av Drosophila frukt fluer har bestemte svar til skiftende temperaturer sine fysiologiske toleranse og tilpasningsevne. Drosophila fluene har en temperatur sensing system som er blitt grunnleggende forståelse nevrale grunnlaget for temperatur på ectotherms. Vi presenterer her en temperatur-kontrollerte arena som tillater rask og presis temperaturendringer med timelige og romlig å utforske responsen av personlige flyr til skiftende temperaturer. Individuelle fluer plasseres i arena og utsatt for pre-programmert temperatur utfordringer, slik som uniform gradvis økning i temperaturen å avgjøre reaksjon normer eller romlig distribuert temperaturer samtidig å bestemme innstillinger. Enkeltpersoner spores automatisk, slik at kvantifisering av hastighet eller plassering foretrukket. Denne metoden kan brukes å kvantifisere raskt svar over en rekke temperaturen å avgjøre temperatur ytelse kurver i Drosophila eller andre insekter av samme størrelse. I tillegg kan det brukes for genetiske studier for å kvantifisere temperatur innstillinger og reaksjoner på mutanter eller vill-type fluer. Denne metoden kan hjelpe avdekke grunnlaget for termisk artsdannelse og tilpasning, samt nevrale mekanismene bak temperatur behandling.
Introduction
Temperaturen er en konstant miljømessige faktoren som påvirker hvordan organismer funksjon og oppføre seg1. Forskjeller i bredde og høyde lede til forskjeller i type klima organisme er utsatt for, som resulterer i evolusjonære utvalg for sine svar temperatur2,3. Organismer reagerer på forskjellige temperaturer gjennom morfologiske, fysiologiske og behavioral tilpasninger som maksimerer ytelsen under deres bestemt miljøer4. For eksempel i frukt fly Drosophila melanogasterhar bestander fra forskjellige regioner forskjellige temperatur innstillinger, kroppen størrelser, utviklingsmessige ganger, lang levetid, fruktbarhet og gangavstand ytelse ved forskjellige temperaturer2 ,5,6,7. Mangfoldet observert mellom flyr av ulike opphav forklares i del av genetisk variasjon og plast gene expression8,9. Tilsvarende Drosophila arter fra ulike områder distribuere annerledes blant temperatur graderinger og Vis forskjeller i motstand mot ekstrem varme og kalde tester10,11,12.
Drosophila har også nylig blitt modellen ønsker å forstå grunnlag genetiske og nevrale temperatur oppfatning13,14,15,16,17. Forstand, voksen fluer oppfatter temperatur gjennom kalde og varme eksterne temperatursensorer i antenner og temperatursensorer i hjernen13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20. periferi receptors for varme temperaturer uttrykke Gr28b.d16 eller Pyrexia21, mens periferien kaldt reseptorer er preget av Brivido14. I hjernen behandles temperatur av neurons uttrykke TrpA115. Atferdsmessige studier av mutanter av disse er å forbedre vår forståelse av hvordan temperaturen behandles og gi innsikt i mekanismer som varierer blant populasjoner av Drosophila fra ulike regioner.
Her beskriver vi en temperatur-kontrollerte arena som gir rask og presis temperaturendringer. Etterforskerne kan forhåndsprogrammere disse endringene, som tillater for standardisert og repeterbare manipulasjoner uten menneskelig inngripen. Fluer registreres og spores med spesialisert programvare for å bestemme sin posisjon og hastigheten på ulike faser av et eksperiment. Det viktigste målet i denne protokollen er gangavstand hastigheten ved forskjellige temperaturer, fordi det er en økologisk relevante indeks fysiologiske ytelse som kan identifisere individuelle termisk tilpasningsevne5. Sammen med temperatur reseptor mutanter, kan denne teknikken hjelpe avslører mekanismer av termisk tilpasning på mobilnettet og biokjemiske nivåer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her har vi presentert en automatisert temperatur-kontrollerte arena (figur 1) som produserer nøyaktig temperaturendringer i tid og rom. Denne metoden kan eksponering av personlige Drosophila ikke bare til forhåndsprogrammert gradvis øker temperatur (figur 2 og Figur 3), men også dynamisk temperatur utfordringer som hvert panel fly arenaen ble oppvarmet uavhengig til en annen temperatur (Figur 4</str…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet var støttes delvis av et stipend fra Behavioural og kognitiv nevrovitenskap Program av universitetet i Groningen og graduate stipend fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) fra Mexico, gitt til Andrea Soto-Padilla og et stipend fra John Templeton grunnlaget for studiet av tiden tildelt Hedderik van Rijn og Jean-Christophe Billeter. Vi er også takknemlige til Peter Gerrit Bosma for sin deltakelse i utvikle FlySteps tracker.
Skriptene TemperaturePhases, FlySteps, og FlyStepAnalysis kan bli funnet som tilleggsinformasjon og i følgende midlertidige og offentlig tilgjengelig kobling:
https://dataverse.nl/privateurl.XHTML?token=c70159ad-4d92-443d-8946-974140d2cb78
Materials
| Arduino Due | Arduino | A000062 | Software RUG |
| Electronics Board | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-Main-02-2014 | |
| Power supply Boost | XP-Power 48. V 65 W | ECS65US48 | Set to 53 Volt |
| Power supply Tile Heating | XP-Power 15. V 80 W | VFT80US15 | |
| Power supply Cooling | XP-Power 15. V 130 W | ECS130U515 | |
| Peltier elements | Marlow Industries | RC12-4 | 2 Elements, controlled DC feed |
| Heat sink | Fisher Technik | LA 9/150-230V | Decoupled for vibration |
| Temperature sensors | Measurement Specialties | MCD_10K3MCD1 | Micro Thermistor Probe |
| Copper block/tiles | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-CB-01-2014 | |
| Auminum ring | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-RoF-02-2015 | |
| Tesa 4104 white tape 25 x 66 mm | RS Components | 111-2300 | White conductive tape |
| Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
| Warm white LED strip | Ledstripkoning | HQ-3528-SMD | 60 LEDs per meter |
| Switch Power Supply | Generic | T-36-12 | |
| Logitech c920 | Logitech Europe S.A | PN960-001055 | |
| QuickTime Player | Apple Computer | Recording program | |
| Tracking analysis software | R | Packages: pacman | |
| Tracking analysis software | MATLAB | ||
| Thermal Imaging | FLIR T400sc | ||
| Graphs and Statisticts Software | Graph Pad Prism | ||
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | Siliconising agent |
| Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
| Flypad | Flystuff | 59-114 | |
| Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25×95 mm |
| Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
| Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
| Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
| Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
| Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
| Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
| Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
| Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
| Molasses | Flystuff | 62-117 | |
| Active dry yeast | Red Star | ||
| Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
Referências
- Abram, P. K., Boivin, G., Moiroux, J., Brodeur, J. Behavioural effects of temperature on ectothermic animals unifying thermal physiology and behavioural plasticity. bioRxiv. , (2016).
- Rajpurohit, S., Schmidt, P. S. Measuring thermal behavior in smaller insects: A case study in Drosophila melanogaster demonstrates effects of sex, geographic origin, and rearing temperature on adult behavior. Fly. 10 (4), 149-161 (2016).
- Jezovit, J. A., Levine, J. D., Schneider, J. Phylogeny environment and sexual communication across the Drosophila genus. The Journal of Experimental Biology. 220 (1), 42-52 (2017).
- Sinclair, B. J., Williams, C. M., Terblanche, J. S. Variation in Thermal Performance among Insect Populations. Physiological and Biochemical Zoology. 85 (6), 594-606 (2012).
- Gibert, P., Huey, R., Gilchrist, G. Locomotor performance of Drosophila melanogaster: Interactions among developmental and adult temperautures, age, and geography. Evolution. 55 (1), 205-209 (2001).
- Trotta, V., et al. Thermal plasticity in Drosophila melanogaster: A comparison of geographic populations. BMC Evolutionary Biology. 6, 1-13 (2006).
- Klepsatel, P., Gálikova, M., De Maio, N., Huber, C. D., Christian, S., Flatt, T. Variation in thermal performance and reaction norms among populations of Drosophila melanogaster. Evolution. 67 (12), 3573-3587 (2013).
- Latimer, C. A. L., Wilson, R. S., Chenoweth, S. F. Quantitative genetic variation for thermal performance curves within and among natural populations of Drosophila serrata. Journal of Evolutionary Biology. 24, 965-975 (2011).
- Chen, J., Nolte, V., Schlotterer, C. Temperature-related reaction norms of gene expression: Regulatory architecture and functional implications. Molecular Biology and Evolution. , (2015).
- Kellermann, V., Overgaard, J., Hoffmann, A. A., Flojgaard, C., Svenning, J. -. C., Loeschcke, V. Upper thermal limits of Drosophila are linked to species distributions and strongly constrained phylogenetically. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16228-16233 (2012).
- Andersen, J. L., Manenti, T., Sørensen, J. G., Macmillan, H. A., Loeschcke, V., Overgaard, J. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
- Krstevska, B., Hoffmann, A. A. The effects of acclimation and rearing conditions on the response of tropical and temperate populations of Drosophila melanogaster and D. simulans to a temperature gradient (Diptera: Drosophilidae). Journal of Insect Behavior. 7 (3), 279-288 (1994).
- Frank, D. D., Jouandet, G. C., Kearney, P. J., Macpherson, L. J., Gallio, M. Temperature representation in the Drosophila brain. Nature. 519 (7543), 358-361 (2015).
- Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. The coding of temperature in the Drosophila brain. Cell. 144 (4), 614-624 (2011).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
- Ni, L., et al. A gustatory receptor paralogue controls rapid warmth avoidance in Drosophila. Nature. 500 (7464), 580-584 (2013).
- Liu, W. W., Mazor, O., Wilson, R. I. Thermosensory processing in the Drosophila brain. Nature. 519 (7543), 353-357 (2015).
- Neely, G. G., et al. TrpA1 Regulates Thermal Nociception in Drosophila. Public Library of Science ONE. 6 (8), e24343 (2011).
- Zhong, L., et al. Thermosensory and non-thermosensory isoforms of Drosophila melanogaster TRPA1 reveal heat sensor domains of a thermoTRP channel. Cell Reports. 1 (1), 43-55 (2012).
- Barbagallo, B., Garrity, P. A. Temperature sensation in Drosophila. Current Opinion in Neurobiology. 34, 8-13 (2015).
- Tang, X., Platt, M. D., Lagnese, C. M., Leslie, J. R., Hamada, F. N. Temperature integration at the AC thermosensory neurons in Drosophila. Journal of Neuroscience. 33 (3), 894-901 (2013).
- Petavy, G., David, J. R., Gibert, P., Moreteau, B. Viability and rate of development at different temperatures in Drosophila: A comparison of constant and alternating thermal regimes. Journal of Thermal Biology. 26 (1), 29-39 (2001).
- Diegelmann, S., Zars, M., Zars, T. Genetic dissociation of acquisition and memory strength in the heat-box spatial learning paradigm in Drosophila. Learning & Memory. 13 (1), 72-83 (2006).
- Zars, M., Zars, T. High and low temperatures have unequal reinforcing properties in Drosophila spatial learning. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 192 (7), 727-735 (2006).
- Zars, T., Wolf, R., Davis, R., Heisenberg, M. Tissue-specific expression of a type I adenylyl cyclase rescues the rutabaga mutant memory defect: in search of the engram. Learning & Memory. 7 (1), 18-31 (2000).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental Brain Research. 46 (5), 320-325 (2011).
