Summary

Количественная оценка деятельности гипопигментация в пробирке

Published: March 06, 2019
doi:

Summary

Мы опишем три экспериментальные методы для оценки деятельности гипопигментация химических веществ в пробирке: количественная оценка деятельности и 2) меланина содержание 1) сотовых тирозиназы и 3) измерение меланина сотовой меланина окрашивание и изображения анализа.

Abstract

Это исследование представляет лабораторных методов для количественной оценки гипопигментация активность в лабораторных условиях. Меланин, основных пигмента в меланоцитов, синтезируется в ответ на несколько клеточных и экологических факторов. Меланин защищает клетки кожи от ультрафиолетового повреждения, но также биофизических и биохимических функций. Чрезмерное производство или накопление меланина в меланоцитов может вызвать дерматологических проблем, таких как веснушки, темные пятна, меланодермия и родинки. Таким образом у людей с клинической или косметических потребностями важен контроль меланогенеза с гипопигментация агентов. Меланин главным образом синтезируется в меланосомы меланоцитов в сложный биохимический процесс, называемый меланогенеза, которая находится под влиянием внешние и внутренние факторы, такие как гормоны, воспаление, возраст и ультрафиолетовых лучей. Мы опишем три метода для определения активности гипопигментация химических веществ или природных веществ в меланоциты: Измерение 1) сотовых тирозиназы активности и содержание меланина 2) и 3) пятная и количественного определения сотовой меланина с изображением анализ.

В меланогенеза тирозиназы катализирует тариф ограничивая шаг, который преобразует L-тирозин в 3,4-Диоксифенилаланин (л-дофа) и затем в допаквинон. Таким образом ингибирования тирозиназы — это основной гипопигментация механизм. В культивированный меланоцитов активность тирозиназы может быть определена количественно, добавляя l-допы как субстрат и измерения допаквинон производства методом спектрофотометрии. Меланогенеза может также измеряться путем количественной оценки содержание меланина. Меланин содержащих сотовой фракция добывается с NaOH и меланина количественно спектрофотометрически. Наконец может быть определена количественно содержание меланина, путем анализа изображений после фонтана-Masson пятнать меланина. Хотя результаты этих анализов в лабораторных условиях не всегда могут быть воспроизведены в коже человека, эти методы широко используются в меланогенеза исследований, особенно в качестве первого шага для выявления потенциальных гипопигментация активности. Эти методы могут также использоваться для оценки активности меланоцитов, роста и дифференцировки. Согласованные результаты с тремя различными методами обеспечения достоверности эффектов.

Introduction

Melanin играет решающую роль в физиологии, патологии и токсикологии ряда органов, включая кожу, глаза и мозг1. Основные функции меланина, Фото скрининг и биохимические эффекты. Меланин поглощает инфракрасный и видимый свет, а также ультрафиолетового (УФ) излучения, с показателями увеличения поглощения при более коротких длинах волн света; Таким образом меланин защищает ткани от повреждения, вызванные видимого света или ультрафиолетового излучения2. Меланин является антиоксидантом и обладает сродством для металлов и других токсичных химических веществ; Таким образом он может защитить тканей от окислительного и химического стресса3. Однако чрезмерное производство меланина вызывает Дерматологические проблемы.

Количество и качество меланина в коже и радужки являются наиболее важными факторами, определяющими цвет радужной оболочки и кожу. Люди могут иметь разные кожи цветовые предпочтения; Некоторые пользу загорелой кожи, в то время как другие выступают светлее цвета кожи. В зависимости от этих профилей потребителя гипопигментация косметики были разработаны для удовлетворения индивидуальных рынков для благоприятствования кожи цвета4. Соответственно исследования гипопигментация и анти melanogenic деятельности являются важными научно и практически.

Меланогенеза — сложный процесс биосинтеза меланина через ряд ферментных и спонтанное химических реакций в меланоциты. Один меланоцит окружена примерно 36 кератиноцитов и меланоцитов являются заводы синтез меланина, которые распространяют их продукт для соседних кератиноцитов. В коже меланин производятся и хранятся в melanosomal отсеке меланоцитов транспортируется в соседних кератиноцитов эпидермиса через дендритов.

L-тирозин служит первоначальный субстрат для меланогенеза и фермента тирозиназы катализирует два последовательных реакций, которые преобразуют L-тирозин в 3,4-Диоксифенилаланин (ДОПЫ), а затем в допаквинон. Эти реакции являются тариф ограничивая шаг в меланогенеза5,6. Соответственно деятельность гипопигментация сначала может измеряться путем оценки активности клеточных тирозиназы непосредственно. Чтобы сделать это, экстракты меланоцитов, содержащие тирозиназы инкубируют с ДОПЫ и допаквинон производится на образцах может измеряться методом спектрофотометрии на 475 Нм. Значения нормализованы по концентрации белка образцов и веществ с гипопигментация результат деятельности в формировании меньше допаквинон, по сравнению с контролем.

Во-вторых гипопигментация активность может быть определена количественно измеряя меланина в культивированный меланоцитов непосредственно. После обработки клеток с испытательным материалом, меланин добывается в щелочных условиях и содержание меланина количественно методом спектрофотометрии на 400 Нм. Агент гипопигментация приведет к более низким содержанием меланина, чем элементы управления7.

Наконец гипопигментация активность может быть квантифицировано фонтана-Masson меланина окрашивание и последующего анализа. В Fontana-Masson окрашивание, гранулы меланина уменьшить аммиака Серебряный нитрат видимое состояние черный металлик и черные области ячеек в микроскопических изображений представляют количество меланина.

Гипопигментация агент обычно дает результаты, последовательной и сопоставимой с помощью этих трех методов, которая подтверждает, что действие вещества является допустимым. Кроме того это может быть полезно для измерения выражение ключевых генов и белков в меланогенеза в ответ на тест вещество для изучения активности гипопигментация. Помимо тирозиназы важнейших ферментов в меланогенеза8являются Тирозиназа связанных белков (ГТО-1) и dopachrome tautomerase (ГТО-2). Транскрипционный фактор фактор транскрипции микрофтальмия связанные (MITF) является основной регулятор меланогенеза и количественная оценка ее уровни выражения гена/белков или промоутера деятельности пробирного также может использоваться для оценки деятельности гипопигментация.

Protocol

1. Подготовка среднего, соединений и реагенты Подготовка полного среднего роста B16F10. Дополнение Дульбекко изменение средних орла (DMEM) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% пенициллина/стрептомицина (ПЕШТ). Чтобы сделать 500 мл полного среднего, смешайте 445 мл среды Дульбекко изм…

Representative Results

Представитель результаты деятельности гипопигментация арбутин, анти melanogenic соединения, в B16F10, меланоцитов приведены ниже. Рисунок 1A показывает, что арбутин значительно подавлена деятельность клеточных тирозиназы, по сравнению с элементом управления,…

Discussion

Мы представили протоколы для оценки гипопигментация активности тестирования соединений с помощью искусственного меланоцитов. Представитель результаты показали гипопигментация эффект арбутин, ингибитор тирозиназы, который препятствует тирозиназы активности и сотовых содержание м?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Кореи институт планирования и оценки технологии в продовольствия, сельского и лесного хозяйства (IPET) через программу развития технологии Agri-биоиндустрии, финансируемая министерством сельского хозяйства, продовольствия и сельских дел (MAFRA ) (116159-02-2-WT011) и школа наук о жизни и биотехнологии для BK21 плюс, Университет Кореи.

Materials

3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine Sigma D9628
Ammonium hydroxide solution Sigma #320145
Arbutin Fluka #10960
DMEM HyClone SH30243.01
FBS HyClone SH30084.03
Formalin Yakuri Pure Chemicals #16223 37%
Gold chloride American MasterTech AHG0226 0.10%
HCl Samchun chemical H0255
KCl Bio basic Canada Inc. PB0440
KH2PO4 Sigma #60218
Na2HPO4 J.T.Baker #3817-01
NaCl Duksan pure chemicals #81
NaOH Sigma 655104
Nuclear fast red Merck 100121 Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.
Penicillin and streptomycin solution HyClone SV30010
Silver nitrate Duksan Pure Chemicals #900
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) J.T. Baker #3817-01
Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4) Sigma S5011
Sodium thiosulfate pentahydrate Duksan Pure Chemicals #2163
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Bio Basic Canada TB0196
Triton X-100 Union Carbide T8787
Tyrosinase from mushroom Sigma T3824 25 KU

Referências

  1. Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells. Pigment Cell & Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).
  2. Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
  3. Galvan, I., Solano, F. Melanin chemistry and the ecology of stress. Physiological and Biochemical Zoology. 88 (3), 352-355 (2015).
  4. Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners. Cosmetics. 3 (4), 36 (2016).
  5. Cooksey, C. J., et al. Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase. Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).
  6. Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase. Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).
  7. Gillbro, J. M., Olsson, M. J. The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents – existing and new approaches. International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).
  8. Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes. Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).
  9. Lee, J. H., et al. Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes. Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).
  10. Jun, H. J., et al. Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression. Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).
  11. Jun, H. J., et al. p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis. European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).
  12. Jun, H. J., et al. Dual inhibition of γ-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism. Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).
  13. Choi, Y. M., et al. Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes. European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).
  14. Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes. Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).
  15. Overwijk, W. W., Restifo, N. P. B16 as a mouse model for human melanoma. Current Protocols in Immunology. , (2001).
  16. Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation. Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).
  17. D’Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E. Signaling pathways in melanogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1144 (2016).
  18. Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).
  19. Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. α-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes. Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).
  20. Hu, D. N. Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).
  21. Carriel, V. S., et al. A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).

Play Video

Citar este artigo
Kim, Y., Kim, M., Kweon, D., Lim, S., Lee, S. Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro. J. Vis. Exp. (145), e58185, doi:10.3791/58185 (2019).

View Video